一种多重刺激响应交联型聚合物纳米水凝胶、其制备方法及应用与流程

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种多重刺激响应交联型聚合物纳米水凝胶、其制备方法及应用。

背景技术：

根据大量研究表明，阿霉素是一种有效的抗癌药物，可抑制rna和dna的合成，对rna的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。但是直接注射后通过体液循环到达肿瘤组织的剂量很低，而且会给人体带来严重的副反应。世界上已经有很多研究来发展目标靶向药物传输体系(drugdeliverysystems,dds)来增强药效和降低副反应，这些药物载体包括各种形态的纳米粒子、胶束、微胶囊、纳米水凝胶等。

在各种药物载体中，聚合物纳米水凝胶是一种理想的药物载体。作为一种通过物理或者化学交联的三维高亲水性的聚合物网络，水凝胶是最接近于人体各种组织细胞的形态，从某种意义上说，人体各种组织都是不同水含量的凝胶。其中，化学交联的纳米水凝胶的高度亲水性和胶体稳定性使得它是一种理想的药物传输载体。

对于目标药物载体，智能型的纳米水凝胶尤其重要，因为它可以选择性的在目标区域释放药物，而在别的区域保持稳定，一般体现为对于ph值、温度、离子浓度、谷胱甘肽或者它们之间的组合的刺激响应性。其中，最重要的是ph、谷胱甘肽和温度的刺激响应性，因为肿瘤组织(ph弱酸性)和正常细胞(ph中性)间，以及细胞外液(ph中性)和细胞内的内涵体和溶酶体(ph酸性)之间存在着明显的差异，而由肿瘤细胞内液和外液不同浓度的谷胱甘肽浓度产生的环境差异则使得谷胱甘肽刺激响应性也非常重要，除此之外由于肿瘤细胞代谢速快，肿瘤组织处温也高于正常值，这使得温度刺激响应性也显得尤为重要。针对这些不同组织部位的不同谷胱甘肽/ph/温度设计多重刺激敏感性的药物载体，可以智能化的控制释药和对于肿瘤细胞具有靶向杀伤性。

然而，目前还未存在对谷胱甘肽、ph、温度刺等多重刺激都具有响应性的纳米水凝胶载体，这也是今后研发的重要方向。

技术实现要素：

基于以上问题，本发明提供了一种多重刺激响应交联型聚合物纳米水凝胶、其制备方法及应用，所述纳米水凝胶是可逆交联、对谷胱甘肽、ph、温度刺激具有响应特性、并具有优异可降解性能的纳米水凝胶，并且该纳米水凝胶的应用是对药物载体领域的一次重要变革。

具体而言，本发明提供一种多重刺激响应交联型聚合物纳米水凝胶的制备方法，其包括下述步骤：

1）在单一的乙醇、乙睛、水、n-甲基吡咯烷酮或甲苯溶剂中，或者在乙醇-水、乙醇-乙睛、乙醇-n-甲基吡咯烷酮或乙醇-甲苯的混合溶剂中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚及/或聚丙二醇二缩水甘油醚、以及具有ph响应特性的单体，在搅拌下回流反应6-24小时；

2）向反应物溶液中加入具有谷胱甘肽刺激响应特性的交联剂继续回流反应12-24小时；

3）反应结束后，将反应混合物沉析、过滤、洗涤，在30-50℃下真空干燥10-24小时，得到多重刺激响应交联型聚合物纳米水凝胶粒子。

根据如上所述的制备方法，体系中除溶剂外的所有成分的总质量与溶剂的比为0.1g/ml-0.5g/ml。

根据如上所述的制备方法，所述聚乙二醇二缩水甘油醚及/或聚丙二醇二缩水甘油醚的数均分子量为200-2000。

根据如上所述的制备方法，所述的具有ph响应特性的单体为哌嗪、甲胺、丙胺、十二胺中的一种或几种。

根据根据如上所述的制备方法，各成分的质量比为：聚乙二醇缩水甘油醚及/或聚丙二醇二缩水甘油醚200份、具有ph响应特性的单体4-60份：具有谷胱甘肽刺激响应特性的交联剂1.9-38份。

根据如上所述的制备方法，所述具有谷胱甘肽刺激响应特性的交联剂为胱胺、2,2'-二硫代二苯胺、3,3'二硫代二丙胺、2,2'二硫代二乙胺中的一种或几种。

根据如上所述的制备方法，在步骤1）中所述的搅拌是在60-80℃下的磁力搅拌；在步骤3）中，所述以甲醇为溶剂对反应混合物进行沉析及洗涤。

本发明还提供一种通过如上所述制备方法制得的多重刺激响应交联型聚合物纳米水凝胶，所述水凝胶的大小为50-950nm，多分散度为0.04-0.16。

并且，本发明还提供一种如上所述的多重刺激响应交联型聚合物纳米水凝胶的应用，将所述纳米水凝胶用作药物载体。

根据如上所述的应用，所述药物为抗癌药物阿霉素。

本发明所述制备方法制得的纳米水凝胶，具有谷胱甘肽、ph、温度刺激响应特性和优异可降解性能。并且，本发明制备工艺清晰简洁，得到的纳米水凝胶药物载体具有谷胱甘肽/ph/温度多重刺激响应性，谷胱甘肽响应性可以使得纳米水凝胶在肿瘤细胞外低谷胱甘肽浓度的环境中保持稳定，长时间循环，很少泄露药物，而在肿瘤细胞内高谷胱甘肽浓度的环境中快速降解，变为小分子量的线性链，从而快速释放药物，达到在目标肿瘤细胞内控制释放抗癌药物的效果。ph和温度响应性则使得纳米水凝胶在内涵体、溶酶体等亚细胞器官内更有效的释放出阿霉素，体现出与谷胱甘肽的协同效应。而凝胶粒子的可生物降解性和降解后的小分子量又可以使得药物载体迅速代谢排出体外，进一步减少对人体的副作用。以上设计思路基本覆盖了药物传递领域所关心的一些基本问题，因此产品具有良好的全面性。

附图说明

图1为本发明的纳米水凝胶的sem形貌图。

图2为本发明的纳米水凝胶在不同ph下的粒径分布图。

图3为本发明的纳米水凝胶在不同温度下的粒径分布图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、多重刺激响应交联型聚合物纳米水凝胶的制备

实施例1

在60ml乙醇中加入20g聚乙二醇二缩水甘油醚(mn=200)及6g无水哌嗪，在60℃磁力搅拌下回流反应6小时；之后向反应物溶液中加入3.8g胱胺继续回流反应12小时；反应结束后，将反应混合物沉析在甲醇中，之后过滤，用甲醇反复洗涤三次产物，在50℃下真空干燥24小时，得到纳米水凝胶粒子。

实施例2

在206ml乙醇中加入20g聚乙二醇二缩水甘油醚(mn=2000)及0.4g无水哌嗪，在80℃磁力搅拌下回流反应24小时；之后向反应物溶液中加入0.19g胱胺继续回流反应24小时；反应结束后，将反应混合物沉析在甲醇中，之后过滤，用甲醇反复洗涤三次产物，在50℃下真空干燥10小时，得到纳米水凝胶粒子。

实施例3

在60ml乙醇中加入20g聚丙二醇二缩水甘油醚(mn=200)及3g丙胺，在70℃磁力搅拌下回流反应12小时；之后向反应物溶液中加入2g胱胺继续回流反应18小时；反应结束后，将反应混合物沉析在甲醇中，之后过滤，用甲醇反复洗涤三次产物，在30℃下真空干燥24小时，得到纳米水凝胶粒子。

实施例4

在60ml乙醇中加入20g聚乙二醇二缩水甘油醚(mn=2000)及1g十二胺，在80℃磁力搅拌下回流反应20小时；之后向反应物溶液中加入1g3,3'二硫代二丙胺继续回流反应20小时；反应结束后，将反应混合物沉析在甲醇中，之后过滤，用甲醇反复洗涤三次产物，在40℃下真空干燥16小时，得到纳米水凝胶粒子。

实施例5

在90ml乙醇中加入20g聚丙二醇二缩水甘油醚(mn=2000)及0.6g甲胺，在80℃磁力搅拌下回流反应24小时；之后向反应物溶液中加入0.19g2,2'二硫代二乙胺继续回流反应24小时；反应结束后，将反应混合物沉析在甲醇中，之后过滤，用甲醇反复洗涤三次产物，在50℃下真空干燥10小时，得到纳米水凝胶粒子。

实施例6

在90ml乙醇中加入20g聚乙二醇二缩水甘油醚(mn=2000)及0.8g哌嗪，在75℃磁力搅拌下回流反应18小时；之后向反应物溶液中加入0.5g2,2'-二硫代二苯胺，继续回流反应18小时；反应结束后，将反应混合物沉析在甲醇中，之后过滤，用甲醇反复洗涤三次产物，在50℃下真空干燥24小时，得到纳米水凝胶粒子。

实施例7

在90ml乙醇中加入20g聚丙二醇二缩水甘油醚(mn=2000)及6g哌嗪，在75℃磁力搅拌下回流反应18小时；之后向反应物溶液中加入3.8g胱胺继续回流反应24小时；反应结束后，将反应混合物沉析在甲醇中，之后过滤，用甲醇反复洗涤三次产物，在50℃下真空干燥24小时，得到纳米水凝胶粒子。

二、多重刺激响应交联型聚合物纳米水凝胶的性能测试

（1）粒径及多分散度测试

取实施例1-7中制得的纳米水凝胶粒子，分别配制1mg/ml的纳米水凝胶水溶液，在zetasizernanozs90仪（malvern）上测定纳米水凝胶的粒径大小和粒径分布，取五次测试的平均值。其中，粒径分布的五次测试平均值为多分散度。另外，4mwhe-nelaser的波长为633nm，测试角为90º，采用contin分析方法。结果如表1所示。

表1

由测试可知，本发明制得的纳米水凝胶为球状，且由表1中测得的数据可知，本发明制得的纳米水凝胶粒径为50-950nm，多分散度为0.04-0.16。

（2）降解性测试

取3个50ml的单口烧瓶，分别加入10mg的纳米水凝胶粒子，然后依次分别加入10ml下述缓冲溶液：磷酸盐缓冲溶液ph=7.4、磷酸盐缓冲溶液ph=6.0、醋酸盐缓冲溶液ph=5.0；然后每个单口烧瓶分别加入20mm的谷胱甘肽，放入恒温摇床(200rpm摇速，37.5℃)匀速振荡12小时。通过gpc测定降解后纳米水凝胶粒子的分子量。对本发明实施例1-7中制得的纳米水凝胶分别进行如上的降解性测试，分子量结果如表2所示。

表2

由表2可知，本发明制得的纳米水凝胶粒子在ph为7.4、6.0和5.0的情况都发生了降解，且分子量均小于3500，远小于代谢阂值(45-50kda)。且ph值越小降解程度越高，从侧面证明本发明所制纳米水凝胶在人体中ph较低的肿瘤细胞降解更快。由此可知本发明制得的纳米水凝胶粒子的降解性优异，并且具有降解选择性，如在肿瘤环境（ph5.0）中降解更快。

（3）载药性测试

将5mg的阿霉素（起始药物量）和25mg的纳米水凝胶，溶于5ml的dmf中，再加入10ul的三乙胺，搅拌24小时。然后将混合溶液在冷冻干燥箱中冻干。精确称取2mg适量冻干后的纳米凝胶载药粉末，溶于4mldmso中，用紫外分光光度计测定吸光度(λ=485nm)，根据阿霉素吸光度的标准曲线得到阿霉素的含量，进而算出阿霉素含量，计算载药率和包封率。对实施例1-7中的制得的纳米水凝胶进行上述实验，结果如表3所示。

载药率和包封率按以下公式计算:

载药率=阿霉素的含量/纳米药物的质量×100%

实际载药量=载药率×上述冻干后的纳米凝胶载药粉末

包封率=实际载药量/起始药物量×100%

表3

由上述表3可知，本发明中制得的纳米水凝胶的载药率及包封率均优异。

（4）释药试验

将8-10mg载药纳米水凝胶粒子分散在8-10ml的两种缓冲溶液中(磷酸盐缓冲溶液ph=7.4；醋酸—醋酸钠缓冲溶液ph=6.0)，超声分散均匀，然后分为4-5份，每份2ml左右，再放入80ml的含不同浓度的谷胱甘肽的缓冲溶液中，即刻开始测试，通过紫外测定药物浓度来计算释药率。在48小时后，从瓶内取出3ml释药的缓冲溶液进行紫外测量，并且分别在25℃、36℃和37.5℃的条件下恒测定。

随机选取实施例1及实施例6制得的纳米水凝胶进行上述实验，药物释放率结果如表4所示。

表4药物释放率结果

由表4可知，关于阿霉素的释放，在高谷胱甘肽浓度、较低ph值条件下和较高温度下展现出较快的释放速度，可以达到65%以上，而在低谷胱甘肽浓度、中性的ph值及低温度条件下保持稳定、释放量小于20%。而众所周知，谷胱甘肽浓度高、ph值低、温度高的条件下，相似于肿瘤细胞内的环境，在该环境下药物释放率高，可实现药物最大量释放的效果，相反，在谷胱甘肽浓度低、ph值高、温度低的条件下，相似于正常细胞内的环境下，药物释放得到控制，保证对正常细胞的安全性。由此可知，通过本发明制得的纳米水凝胶，谷胱甘肽浓度、ph值及温度具有刺激响应性，通过本发明的纳米水凝胶对药物包封可实现药物选择性释放的效果。

为了进一步验证本发明的ph和温度刺激响应特性，随机选取实施例3的纳米水凝胶溶液，在不同温度和ph下测试了它们的粒度分布。有图2可知，在不同的ph下，纳米水凝胶粒子的粒径不同，从而侧面证明该水凝胶粒子有ph响应特性；相同的，由图3可知，本发明制备的纳米水凝胶粒子具有温度响应特性。

（3）细胞试验

将子宫肿瘤细胞接种于96孔板中，每孔加入100uldmem完全培养基。在37^oc和5%浓度co2空气环境下培养24小时然后吸去培养液，每孔加入浓度为200ug/ml的载有阿霉素药物的聚合物纳米水凝胶粒子的培养基（100ul），一起培养，并用荧光显微镜进行观察。其中载药的具体操作同（3）载药试样中操作一致。通过荧光显微镜进行观察，发现6h后载药纳米水凝胶粒子已经进入细胞，12h后阿霉素药物对于细胞的杀伤作用已经非常明显，细胞存活率大幅降低，剩余的少量细胞也处于皱缩状态，说明所制备的纳米水凝胶是一种较好的药物载体。