本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于恒温隔绝式荧光pcr平台的猪delta冠状病毒检测试剂盒及应用。
背景技术：
猪delta冠状病毒(pdcov)于2009年在香港的分子监测研究中首次被发现，但是其临床意义却没有进行研究。美国俄亥俄州在2014年2月首次出现了该病并且迅速蔓延到了美国其它州。2014年4月韩国也在猪上发现了pdcov。最近中国大陆和泰国也出现了该病。研究表明pdcov能导致胃小凹上皮坏死、小肠绒毛萎缩和轻微的间质性肺，在动物实验上证实pdcov能够引起严重腹泻、呕吐和肠炎。该病发病率较高，死亡率为30％-40％，给养猪业带来了巨大的经济损失。
pdcov临床症状与猪流行性腹泻病毒(pedv)和猪传染性胃肠炎(tgev)相似，均为呕吐、水样腹泻、脱水等，症状相似，较难区分，故早期的鉴别诊断尤为重要，病原检测可以提供感染的直接证据，是最可靠的诊断手段，pcr、荧光定量pcr是最为常用的病原学检测手段，尤其荧光定量pcr具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，已经成为动物疫病诊断的主流手段。但是普通的荧光定量pcr方法由于需要大型设备、操作复杂、反应时间长等因素制约了其在现场快速检测方面的应用，因此针对pdcov建立一种快速、敏感、特异、适用于现场的检测方法迫在眉睫。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种基于恒温隔绝式荧光pcr平台的猪delta冠状病毒检测试剂盒及应用，本发明是基于恒温隔绝式荧光pcr的一种简单、快速、灵敏度高和特异强的检测方法，可以现场对猪delta冠状病毒的检测提供科学依据，对保障仔猪业健康发展具有重要意义。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于恒温隔绝式荧光pcr平台的猪delta冠状病毒检测的引物和探针，引物和探针包括：猪delta冠状病毒上游引物和猪delta冠状病毒下游引物和猪delta冠状病毒探针，其中，所述猪delta冠状病毒上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述猪delta冠状病毒下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述猪delta冠状病毒探针的核苷酸序列如seqidno.3所示；猪delta冠状病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有fam标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和bhq。
本发明还公开了一种上述的引物和探针在制备猪delta冠状病毒检测试剂盒方面的应用。
本发明还公开了一种基于恒温隔绝式荧光pcr平台的猪delta冠状病毒检测试剂盒，包括反应缓冲液、荧光定量pcr反应液冻干管、阳性对照品和阴性对照品冻干管；
所述荧光定量pcr反应液冻干管包括taq酶1μl、反转录酶1.25μl、猪delta冠状病毒上游引物、猪delta冠状病毒下游引物各3.5μl和猪delta冠状病毒探针0.25μl、dntps4μl；
所述检测用引物为猪delta冠状病毒上游引物和猪delta冠状病毒下游引物，猪delta冠状病毒上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述猪delta冠状病毒下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述猪delta冠状病毒探针的核苷酸序列如seqidno.3所示；猪delta冠状病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有fam标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和bhq。
进一步地，所述taq酶的终浓度为5u·μl-1，反转录酶的终浓度为20u·μl-1，猪delta冠状病毒上游引物和猪delta冠状病毒下游引物的终浓度均为10μmol·μl-1，猪delta冠状病毒探针的终浓度为10μmol·μl-1，dntps的终浓度为2.5mm。
进一步地，荧光定量pcr反应液冻干管通过以下方法制备得到：将上述的taq酶、反转录酶、猪delta冠状病毒上游引物、猪delta冠状病毒下游引物和猪delta冠状病毒探针、dntps混合加入0.5ml的pcr管中降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管，制得荧光定量pcr反应液冻干管。
进一步地，所述荧光定量pcr反应液冻干管设置有50管。
进一步地，所述反应缓冲液由以下组分构成：500mmkcl、ph8.3、100mmtris-hcl、15mmmgcl2，余量为ddh2o，以上体积总量为3ml。
进一步地，所述阳性对照品冻干管通过以下方法制备得到：将含有猪delta冠状病毒rna片段的rna样品100μl装入pcr管中，降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管制备而成；所述阴性对照品冻干管通过以下方法制备得到：将无猪delta冠状病毒rna片段的样品100μl装入pcr管中，降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管制备而成。
进一步地，该试剂盒保存于4℃下。
本发明还公开了一种基于恒温隔绝式荧光pcr平台的猪delta冠状病毒检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)制备rna模板：取粪便样本上清液200μl，参考金瑞泓捷(厦门)生物科技有限公司的petnad试剂盒提取说明书提取被检样本上清总rna，制备得到rna模板；
2)荧光pcr反应体系的制备：荧光pcr反应体系的制备于冰上操作；取100μl反应缓冲液加入到阳性对照品冻干管中混合，制备得到阳性对照品，然后取50μl反应缓冲液和5μl阳性对照品加入荧光定量pcr反应液冻干管中，制备得到阳性对照反应体系；取100μl反应缓冲液加入阴性对照品冻干管中，制备得到阴性对照品，然后取50μl反应缓冲液和5μl阴性对照品加入荧光定量pcr反应液冻干管中，制备得到阴性对照反应体系；取50μl反应缓冲液和5μl检测样本rna加入荧光定量pcr反应液冻干管中，制备得到样本反应体系；然后分别从各个反应体系中取50μl混合物移入恒温隔绝式荧光pcr反应管中；加样时注意避光操作。将制备好的荧光定量pcr反应管瞬时高速离心5s，避免出现气泡；
3)扩增检测：把pcr反应管放置于恒温隔绝式荧光pcr仪器内，按运行键，即开始反应；
4)检测结果判定：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明提供了一种猪delta冠状病毒的荧光pcr检测试剂盒，其优点是特异性强、灵敏度高、检测时间短、无污染、无需电泳，可在现场快速检测。
2)本发明能快速、准确地检测出被检样本中的猪delta冠状病毒rna，也可用于猪delta冠状病毒的分子流行病学调查。
3)本发明的荧光定量pcr反应液中包括反转录酶和pcr扩增酶，使核酸的反转录和扩增在同一管中进行，简化了操作，节省了试剂同时闭管操作降低了rna的降解和污染的可能性。
4)荧光定量pcr反应液、阳性和阴性对照品均采用冻干方式制备，降低了试剂盒的保存条件，可4℃保存一年时间，便于运输，方便储存，同时提高了试剂的稳定性。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明pockitmicro仪器的结构图；
图2是本发明阳性样本灵敏度检测结果，其中，1：1.02×104copies/μl；2：1.02×103copies/μl；3：1.02×102copies/μl；4：1.02×101copies/μl。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1基于恒温隔绝式荧光pcr平台的猪delta冠状病毒检测试剂盒
一种基于恒温隔绝式荧光pcr平台的猪delta冠状病毒检测试剂盒，包括以下组分：
(1)反应缓冲液：3ml，由500mmkcl、100mmtris-hcl(ph8.3)、15mmmgcl2和ddh2o(余量)组成。
(2)荧光定量pcr反应液冻干管(50管)：
荧光定量pcr反应液包括taq酶1μl/管(5u·μl-1)、反转录酶1.25μl/管(20u·μl-1)、检测用上下游引物各3.5μl/管(10μmol·μl-1)和探针0.25μl/管(10μmol·μl-1)、dntps4μl/管(2.5mm)；将以上混合物加入0.5ml的pcr管中降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管，制得荧光定量pcr反应液冻干管。其中，检测猪delta冠状病毒的上下游引物和探针共3条，扩增出pdcovs基因的长度为102bp。上游引物序列:5’-ctcaccacttactaactcta-3’,seqidno:1；下游引物序列:5’-ctgagagtgtggttagtta-3’，seqidno:2；探针序列：fam-ccttcatcggagttaccaaccact-bhq1，seqidno:3。
(3)阳性对照品冻干管(1管)：将含有猪delta冠状病毒rna片段的rna样品100μl装入pcr管中，降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管制备而成；
(4)阴性对照品冻干管(1管)：将无猪delta冠状病毒rna片段的样品100μl装入pcr管中，降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管制备而成。
本试剂盒保存于4℃，运输需加冰袋。
实施例2基于恒温隔绝式荧光pcr平台的猪delta冠状病毒检测试剂盒的使用方法
该方法包括以下步骤：
1)rna模板：取粪便样本上清液200μl，参考金瑞泓捷(厦门)生物科技有限公司的petnad试剂盒提取说明书提取被检样本上清总rna，制备得到rna模板；
2)荧光pcr反应体系的制备：荧光pcr反应体系的制备于冰上操作；
取100μl反应缓冲液加入到阳性对照品冻干管中混合，制备得到阳性对照品，然后取50μl反应缓冲液和5μl阳性对照品加入荧光定量pcr反应液冻干管中，制备得到阳性对照反应体系；取100μl反应缓冲液加入阴性对照品冻干管中，制备得到阴性对照品，然后取50μl反应缓冲液和5μl阴性对照品加入荧光定量pcr反应液冻干管中，制备得到阴性对照反应体系；取50μl反应缓冲液和5μl检测样本rna加入荧光定量pcr反应液冻干管中，制备得到样本反应体系；然后分别从各个反应体系中取50μl混合物移入恒温隔绝式荧光pcr反应管中。加样时注意避光操作。将制备好的荧光定量pcr反应管瞬时高速离心5s，避免出现气泡。
3)扩增检测：把pcr反应管放置于恒温隔绝式荧光pcr(pockitmicro)仪器内(如图1所示)，按运行键，即开始反应；
4)检测结果判定：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
实施例3标准品制备和灵敏度的测定
取粪便样本上清液200μl，参考金瑞泓捷(厦门)生物科技有限公司的petnad试剂盒提取说明书提取被检样本上清总rna，然后参照宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒说明书将总rna反转录成cdna。
用pdcov的引物分别对上述制备的cdna进行pcr扩增，以相应病原cdna为阳性对照，无模板为阴性对照。反应体系为：cdna2.0μl，2×taqpcrmastermix12.5μl，上、下游引物各1.0μl，ddh2o8.5μl,总体积共25μl。pcr扩增条件为:95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃40s，30次循环，72℃10min。pcr产物经3％琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒回收目的片段，并将其克隆至pmd19-t载体(宝生物工程有限公司)，并转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选出阳性克隆接入含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃培养8h，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，送生工生物有限公司测序。测序正确的阳性质粒作为pdcov阳性标准品，核酸蛋白检测仪测定其浓度，按照下述公式计算核酸浓度：阳性标准品浓度(copies/μl)＝(6.02×1023copies/mol)×(30.15ng/μl)×10-3/(1.78×106g/mol)＝1.02×1010copies/μl。将阳性标准品10倍梯度稀释(10-1～10-10)，对104、103、102和101四个稀释度样本进行检测，各反应管放入pockitmicro反应孔，按“运行键”即可，42分钟后反应结束，阳性结果为“+”，阴性结果为“-”，结果如图2所示，其中104、103、102结果为“+”101结果为“-”，说明本试剂盒的最低检测限为102copies/μl。
实施例4特异性和稳定性检验
用本发明研制的试剂盒对13份pdcov阳性样本、7份阴性样本以及10种相关病毒tgev、ppv、csfv、prrsv、porv、prv、jev、pedv、no311、to412进行检测，并设立pdcov阳性标准品作为对照，以评价试剂盒的特异性，结果显示对13份pdcov阳性核酸样本的检测为阳性，7份阴性样本、和10种相关病毒检测结果为阴性，证明该方法特异性好。
用研制的试剂盒对pdcov的5个稀释度的阳性标准品分别检测3次，以评价该试剂盒的稳定性，结果显示3次检测结果一致，表明试剂盒的稳定性良好。
实施例5试剂盒的临床应用及与普通荧光定量pcr方法比较
用本发明试剂盒和zhangjq(zhang,j.,tsai,y.l.,lee,p.a.,chen,q.,zhang,y.,chiang,c.j.,shen,y.h.,li,f.c.,chang,h.g.,gauger,p.c.,harmon,k.m.,wang,h.t.,2016.evaluationoftwosingleplexreversetranscription-insulatedisothermalpcrtestsandaduplexreal-timert-pcrtestforthedetectionofporcineepidemicdiarrheavirusandporcinedeltacoronavirus[j].j.virol.methods234,34–42.)建立的荧光定量pcr方法对提取的13份pdcov阳性样本和7份阴性样本核酸进行检测，比较两种pcr方法的符合率。结果显示13份pdcov阳性样本中，试剂盒检出的阳性样本数为13个，符合率为100％；而zhangjq等建立的荧光定量pcr方法对总rna检出的阳性样本数为11个，符合率为84.6％。两种方法对7份阴性样本检出结果均为阴性，符合率为100％；故总符合率为90.0％。将荧光定量pcr未检出的而试剂盒检出为阳性的pcr产物测序，测序结果证实为pdcovs基因的特异序列。
以上结果表明试剂盒的临床应用效果良好，检出率高于普通荧光定量pcr方法，同时荧光定量方法耗时两个半小时，而恒温隔绝式pcr仅需42分钟即可出结果，并且因其操作简单和小巧便携性更适用于现场检测应用。
本发明试剂盒与pockitmicro仪器配合使用，操作简单，便携，适用于临床检出，目前还没有市售的试剂盒。
本发明对反应试剂进行了冻干，降低了试剂盒保存条件，便于运输和临床应用。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
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<110>西南民族大学
<120>基于恒温隔绝式荧光pcr平台的猪delta冠状病毒检测试剂盒及应用
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