一种能够降解邻苯二甲酸酯的赤红球菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物及生物降解领域，具体地，涉及一种赤红球菌(rhodococcusruber)yc-yt1及其应用。

背景技术：

邻苯二甲酸酯(phthalateacidesters，简称paes)，又称酞酸酯，是邻苯二甲酸形成的酯类统称。邻苯二甲酸酯是一类以人工合成为主要来源的环境内分泌干扰物，主要用于制备聚氯乙烯材料，起到增塑剂的作用。作为增塑剂，paes在塑料制品中的含量占20％～30％左右，甚至高达50％。自上世纪50年代聚氯乙烯(pvc)面世以来，paes就得到大规模的生产。目前，它占据全球增塑剂市场80％份额以上。除了作为增塑剂外，paes还广泛用于油漆、粘合剂、驱虫剂、化妆品、香料和润滑剂的生产原料。在德国，每年paes的消耗达到四十万吨，全球每年paes的使用量在820万吨以上，其中1％以上通过渗漏进入环境。目前，paes在全球主要工业国的生态环境中已普遍检出。paes已成为全球最常见的污染物之一。因此，如何实现对环境中邻苯二甲酸酯类污染物的高效降解，成为亟待解决的问题。

邻苯二甲酸酯共有30多种，大多是无色透明的油状液体,一般难溶于水,易溶于有机溶剂,属中等极性物质,可通过呼吸、饮食和皮肤接触进入人和动物体内。邻苯二甲酸酯对人体健康的影响是一个慢性的过程,需要较长的时间才会出现,而且可能通过胎盘和授乳产生跨代影响,所以目前主要通过动物实验对其毒性进行研究。动物实验表明,邻苯二甲酸酯急性毒性不大,对ames试验(污染物致突变性检测)呈阴性反应,但在大剂量情况下,对动物有致畸、致癌和致突变作用。其亚急性毒性主要表现为损害肝、肾、睾丸,抑制精子形成,影响生殖机能等。邻苯二甲酸酯含有较弱的雌性荷尔蒙活性成分。近来的研究指出，paes主要的危害在于环境激素作用，可在极低的浓度下干扰人和动物的内分泌系统。其对内分泌系统的扰乱是通过雌激素受体(estrogenreceptor)介导的反应，通过与雌激素受体结合，作用于dna中雌激素反应元件(estrogenrespoponsiveelement)激活基因的转录，产生雌激素效应。动物实验表明，作为内分泌干扰物，paes的生化效应表现为过氧化酶体增生、足细胞毒性、肝脏促进作用、抗雄激素、体外雌激素活性等。对动物生殖方面的扰乱主要是使精囊萎缩、精子数量减少以至于精子形成中止、生殖能力下降、后代数量减少、体重下降、子宫粘膜组织增生等。具有环境激素作用的邻苯二甲酸酯类物质有十几种，其中邻苯二甲酸二甲酯(dmp)、邻苯二甲酸二乙酯(dep)、邻苯二甲酸二丙酯(dipropylphtalate，dpp)、邻苯二甲酸二正丁酯(dbp)、邻苯二甲酸二辛酯(dioctylphthalate，dop)和邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)属于美国环保局认定的优先污染物。

paes在环境中的水解、光解的速率十分缓慢，微生物降解是其矿化的主要途径。近年来，paes的细菌降解已经得到广泛的研究，大量高效降解paes的菌株已经从各类环境中分离得到。同时，细菌对paes的代谢途径和邻苯二甲酸降解的遗传机制也得到深入的研究。但是对其降解的遗传机制的研究主要集中在对参与从邻苯二甲酸到原儿茶酚降解的酶基因进行克隆和鉴定，尚未深入到蛋白方面的研究；并且对于从邻苯二甲酸酯到邻苯二甲酸两步脱酯过程中涉及到的酶基因研究较少。而且目前缺少在实际环境中应用的报道，例如工业废水的环境条件比较苛刻，高盐，极端ph，污染物种类丰富等，这些都对微生物的耐受性提出了更高的要求。因此，寻找在高盐浓度下依然保持对多种邻苯二甲酸酯类污染物的降解能力的菌株对于治理环境污染具有重要的经济价值和现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株能够降解邻苯二甲酸酯的赤红球菌yc-yt1及其在邻苯二甲酸酯类物质降解中的应用。

本发明的菌株yc-yt1是从广东省深圳市南山区西丽镇新围村旺棠工业区附近水渠中分离到一株能够降解邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、邻苯二甲酸二环己酯(dchp)、邻苯二甲酸二甲酯(dmp)、邻苯二甲酸二正丁酯(dbp)、邻苯二甲酸二乙酯(dep)等多种邻苯二甲酸酯的细菌。

在电镜下观察(图1)，该菌形态细胞多样，从圆球状萌芽成短杆状，无鞭毛，无芽孢。菌落呈圆形，边缘光滑，粘质色素为橙黄色素(图2)。菌株革兰氏染色、过氧化氢酶活性及脲酶反应均为阳性；氧化酶活性和吲哚反应为阴性。基于形态特征、生理生化特征，将该菌株鉴定为赤红球菌rhodococcusruber，命名为yc-yt1。该菌株于2017年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.13959，分类名为赤红球菌rhodococcusruber。

本发明提供了含有赤红球菌yc-yt1的菌剂。

本发明提供了含有赤红球菌yc-yt1的生物清洁剂。

本发明提供了赤红球菌yc-yt1或含有其的菌剂或含有其的生物清洁剂在清洁环境中的应用。

进一步，本发明提供了赤红球菌yc-yt1或含有其的菌剂或含有其的生物清洁剂在降解污染物中的应用。

其中，所述的有机污染物为邻苯二甲酸酯类物质。所述邻苯二甲酸酯类物质包括邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、邻苯二甲酸二环己酯(dchp)、邻苯二甲酸二甲酯(dmp)、邻苯二甲酸二乙酯(dep)、邻苯二甲酸二丁酯(dbp)、邻苯二甲酸二丙酯(dprp)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(bbp)、邻苯二甲酸二戊酯(dap)、邻苯二甲酸二已酯(dhp)、邻苯二甲酸二庚酯(dhpp)、邻苯二甲酸二辛酯(dop)、邻苯二甲酸二壬酯(dnp)、邻苯二甲酸二癸酯(ddp)。

本发明进一步提供所述赤红球菌yc-yt1在制备邻苯二甲酸酯类物质的生物降解剂中的应用。

本发明提供了赤红球菌yc-yt1在制备生物清洁剂中的应用。

本发明的赤红球菌yc-yt1在模拟废水处理中，可将无机盐离子培养基(含70g/lnacl)中同时含有的dehp、dchp、dmp、dbp和dep高效降解，7天内降解率均在90％以上。

本发明的赤红球菌yc-yt1可将无机盐离子培养基中各100mg/l的dehp、dprp和bbp完全降解，对菌株进行连续转接测定降解能力，表明该菌降解能力稳定。该菌对于盐离子浓度、ph和温度具有较宽的耐受范围，能分别在nacl浓度为0-70g/l，80-120g/l的无机盐离子培养基中含有的100mg/l的dehp在3天内的降解率大于98％和85％；在ph4-10的范围内能够高效降解dehp，当ph5.0-10.0时，对无机盐离子培养基中100mg/l的dehp在3天内的降解率为100％，能在10～50℃温度范围内高效降解dehp，16℃和30℃条件下，60h内可完全降解无机盐离子培养基中100mg/l的dehp。当nacl浓度大于120g/l，或温度高于50℃，或ph大于11或小于4时，dehp降解被显著抑制。

本发明提供的赤红球菌yc-yt1及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，能够应用于多种邻苯二甲酸酯类环境污染的生物修复及具有较高浓度邻苯二甲酸酯生产废水的处理，降解谱广，可在较低和较高温度下进行生物修复，可广泛应用于环境土壤清洁领域及工业废水的清洁处理，具有较好的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为本发明赤红球菌yc-yt1在电镜下的形态结构图。

图2为本发明赤红球菌yc-yt1在lb固体培养基上的菌落形态。

图3为本发明赤红球菌yc-yt1的16srrna基因系统发育树图。

图4为本发明赤红球菌yc-yt1在含不同邻苯二甲酸酯底物的无机盐离子培养基中对100mg/ldehp的降解率。

图5为本发明实例2中的gc法检测赤红球菌yc-yt1对浓度分别100mg/l的ddp、dnp、dop、dchp、dehp、bbp、dhpp、dhp、dap、dbp、dprp、dep、dmp的降解能力。

图6a为本发明实施例2中的ddp、dop、dbp、dpep和dhp浓度与302nm处吸收峰面积关系标准曲线图；图6b为本发明实施例2中的dmp、dep、dprp和dnp浓度与302nm处吸收峰面积关系标准曲线图；图6c为本发明实施例2中的bbp、dehp、dchp和dhpp浓度与302nm处吸收峰面积关系标准曲线图。

图7为本发明赤红球菌yc-yt1在不同ph的无机盐离子培养基中对100mg/ldehp的降解率。

图8a和图8b为本发明实施例2中赤红球菌yc-yt1在不同氯化钠浓度的无机盐离子培养基中对100mg/ldehp的降解率。

图9为本发明实施例2中赤红球菌yc-yt1在不同温度浓度的无机盐离子培养基中对100mg/ldehp的降解率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本申请使用的无机盐培养基具有以下组成：1.0g/lnh4no3,0.5g/lnacl,0.5g/l(nh4)2so4,0.5g/lkh2po4,1.5g/lk2hpo4和0.005g/l酵母提取物，ph＝7.0±0.2。

斜面培养基：10.0g/l蛋白胨，5.0g/lnacl，10.0g/l酵母提取物，ph＝7.0±0.2。

平板培养基为相应的培养基中加入1.5％的琼脂。

实施例1赤红球菌yc-yt1的分离和鉴定

1、菌株的分离

活性污泥样品采集于广东省深圳市南山区西丽镇新围村旺棠工业区附近水渠。在无菌操作条件下，将10g活性污泥样品接种到用100ml含100mg/ldehp的无机盐离子培养基中，在30℃，180rpm条件下培养。每培养7天后，取培养体积的5％转接至新鲜无机盐培养基中，且每次将dehp的浓度提高100mg/l，连续转接3次，直至无机盐培养基中dehp浓度提高到300mg/l。

将驯化后的菌液划线到含有100mg/ldehp的无机盐培养基平板上，30℃培养箱中培养3天。挑取在平板上的单菌落进行划线后培养，重复三次，直至分离获得纯化的菌株。挑取纯化后的单菌落转接到含浓度为100mg/ldehp的无机盐液体培养基中培养7天，将生长好、传代稳定且降解能力较好的菌株进行斜面保存。菌株命名为yc-yt1。

2、菌株的形态学特征

该菌为革兰氏染色阳性，圆形萌芽成短杆菌，形态多样，无鞭毛，无芽孢(见图1)；在lb培养基上菌落为橙黄色，湿软，圆形凸起，边缘规整，不透明，表面光滑(见图2)。

3、16srdna鉴定

将菌株yc-yt1接种到lb培养基中，30℃、180rpm条件下过夜培养，取3ml菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组dna，得到的基因dna用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测，-20℃保存备用。

设计用于扩增16srdna序列的一对通用引物：27f5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r5'-ggttaccttgttacgactt-3'，用基因组dna作为模板，加入premixtaq^tm，进行pcr扩增，pcr产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，用dna纯化回收试剂盒纯化，连接到pgm-t载体上，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布到含有氨苄青霉素的lb固体培养基平板上，在37℃下培养12h，挑取白色菌落至液体lb培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海生工生物公司进行测序。将该序列在ncbi网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行blast比对分析，并利用mega6.0软件构建系统发育树(图3)可知，菌株yc-yt1为红球菌，与目前已发表的赤红球菌序列具有较高相似性。

4、biolog鉴定

将菌株yc-yt1接种到lb培养基平板中，30℃条件下倒置培养5天，挑单菌落到biologa液和b液中，分别使液体的透光率由100％降至98％和95％，然后按照每孔100μl将a液、b液分别加入biolog培养板中，30℃培养33h，用biolog微生物鉴定仪进行检测分析，结果显示yc-yt1为赤红球菌(rhodococcusruber)。

综合菌体形态、16srdna基因序列以及biolog结果，菌株yc-yt1被鉴定赤红球菌(rhodococcusruber)。

综合菌体形态、生理生化特性和16srdna基因序列，菌株yc-yt1被鉴定为赤红球菌(rhodococcusruber)。该菌株yc-yt1于2017年03月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.13959，分类名为赤红球菌rhodococcusruber。

实施例2赤红球菌yc-yt1的降解性能试验

1、赤红球菌yc-yt1对浓度为100mg/l的邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、邻苯二甲酸二丙酯(dprp)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(bbp)、邻苯二甲酸二甲酯(dmp)、邻苯二甲酸二乙酯(dep)、邻苯二甲酸二丁酯(dbp)、邻苯二甲酸二戊酯(dap)、邻苯二甲酸二已酯(dhp)、邻苯二甲酸二庚酯(dhpp)、邻苯二甲酸二环已酯(dchp)、邻苯二甲酸二辛酯(dop)、邻苯二甲酸二壬酯(dnp)、邻苯二甲酸二癸酯(ddp)的降解能力见图4。

高效气相色谱法检测赤红球菌yc-yt1对无机盐培养基中邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、邻苯二甲酸二丙酯(dprp)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(bbp)、邻苯二甲酸二甲酯(dmp)、邻苯二甲酸二乙酯(dep)、邻苯二甲酸二丁酯(dbp)、邻苯二甲酸二戊酯(dap)、邻苯二甲酸二已酯(dhp)、邻苯二甲酸二庚酯(dhpp)、邻苯二甲酸二环已酯(dchp)、邻苯二甲酸二辛酯(dop)、邻苯二甲酸二壬酯(dnp)、邻苯二甲酸二癸酯(ddp)具有同时降解作用。

将菌株yc-yt1接种到液体lb培养基中活化，培养到对数生长期od600＝0.8，按照体积比5％的接种量接种到同时含邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、邻苯二甲酸二丙酯(dprp)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(bbp)邻苯二甲酸二甲酯(dmp)、邻苯二甲酸二乙酯(dep)、邻苯二甲酸二丁酯(dbp)、邻苯二甲酸二戊酯(dap)、邻苯二甲酸二已酯(dhp)、邻苯二甲酸二庚酯(dhpp)、、邻苯二甲酸二环已酯(dchp)、邻苯二甲酸二辛酯(dop)、邻苯二甲酸二壬酯(dnp)、邻苯二甲酸二癸酯(ddp)各100mg/l混合物的无机盐培养基中，作为处理组，以未接种菌株的含邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、邻苯二甲酸二丙酯(dprp)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(bbp)、邻苯二甲酸二甲酯(dmp)、邻苯二甲酸二乙酯(dep)、邻苯二甲酸二丁酯(dbp)、邻苯二甲酸二戊酯(dap)、邻苯二甲酸二已酯(dhp)、邻苯二甲酸二庚酯(dhpp)、邻苯二甲酸二环已酯(dchp)、邻苯二甲酸二辛酯(dop)、邻苯二甲酸二壬酯(dnp)、邻苯二甲酸二癸酯(ddp)各100mg/l混合物的无机盐培养基作为对照组，对照组与处理组各设三个重复。将对照组与处理组在30℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养，在培养的第7天停止培养并测定每种物质的浓度。

向取得的样品中加入等体积的正已烷超声波充分振荡抽提10分钟，静置1小时，取上层有机溶剂，将有机溶剂挥发干后，用等体积的甲醇重溶，然后用0.22μm的有机系滤膜过滤，进行gc分析。

gc分析条件为：shimadzugc-2010高效气相色谱仪，仪器配置为：rtx-1301毛细管柱(30.0m×0.25mm×0.25μm)与离子捕获检测器(ecd)，检测条件：样品进口温度300℃，检测器温度300℃，柱箱温度280℃，载气为氮气(纯度≥99.999％，流速为30ml/min)，＝进样体积1.0μl，使用软件gcsolution(v2.32.00,shimadzu)对结果进行分析，确定ddp、dnp、dop、dchp、dehp、bbp、dhpp、dhp、dap、dbp、dprp、dep、dmp的保留时间分别为：16.358min、14.173min、12.296min、9.995min、9.608min、8.161min、7.732min、6.393min、5.377min、4.575min、3.970min、3.624min、3.515min；(图5)；邻苯二甲酸酯标准品绘制浓度与302nm处吸收峰面积之间的标准曲线(图6a-图6c)。

降解率的计算：根据不同底物的标准曲线计算每种底物在无机盐培养基中每天的残留浓度，再根据降解率计算公式得到菌株yc-yt1对底物的降解率(表1)。

降解率％＝(对照组中底物的终浓度-处理组中底物的终浓度)/对照组中底物的终浓度×100％

自然降解率％＝(底物初始浓度-对照组中底物浓度)/底物初始浓度×100％

表1各菌株yc-yt1对种底物的降解率与底物的自然降解率

2、赤红球菌yc-yt1对ph的耐受

分别配制不同ph值(4、5、6、7、8、9、10)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基中分别加入dehp至底物浓度100mg/l。将菌株yc-yt1接种到液体lb培养基中活化，培养到对数生长期od600＝0.8，按照体积比5％的接种量接种到上述培养基中，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株不同ph的同时加入dehp至浓度为100mg/l的相同培养基作为对照组，同样在30℃，180rpm摇床振荡避光培养，培养3天后测定溶液中dehp浓度并计算降解率。

图7为3天内不同ph条件下赤红球菌yc-yt1对dehp降解率。当ph值从4.0增加到5.0，dehp的降解率逐渐由40％增加到99％以上。当ph值由7.0升高到8.0时，yc-yt1对dehp的降解效率由100％逐渐降低至90％。当ph值大于8，ph＝9或10.0时，yc-yt1对dehp的降解率又回升至最高值100％。

3、赤红球菌yc-yt1对盐浓度耐受能力

分别配制不同nacl浓度(1、3、5、7、10、15、20、25、40、50、60、70、80、90、100、110和120g/l)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基分别加入dehp至底物浓度100mg/l。将菌株yc-yt1接种到液体lb培养基中活化，培养到对数生长期od600＝0.8，按照体积比5％的接种量接种到上述培养基中，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株的含有不同nacl浓度同时加入dehp至浓度为100mg/l的相同无机盐离子培养基作为对照组，同样在30℃下，180rpm摇床振荡避光培养。培养60小时后测定溶液中dehp浓度，并计算降解率。

图8a和图8b为60小时内不同盐浓度条件下，赤红球菌yc-yt1对dehp的降解率。结果显示，当nacl浓度在1～100g/l之间时，60小时内菌株对dehp的降解率在90-98％，当nacl浓度为110g/l时，底物降解率下降至60％；当nacl浓度提高至120g/l时，底物降解率又回升至85％以上。由此说明，菌株yc-yt1具有较好的耐盐能力，能在较高盐浓度(≤100g/l)条件下高效降解dehp。当nacl浓度达到一定浓度时，菌株自身代谢调控系统做出一定的调整，以便适应更极端的环境条件。

4、赤红球菌yc-yt1对温度耐受能力

将菌株yc-yt1接种到液体lb培养基中活化，培养到对数生长期od600＝0.8，按照体积比5％的接种量接种无机盐离子培养基(dehp浓度为100mg/l)中，分别在10℃、16℃、30℃、40℃、50℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株的含100mg/ldehp的相同无机盐离子培养基作为对照组，同样在10℃、16℃、30℃、40℃、50℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养60小时后测定溶液中dehp浓度并计算降解率。

图9为60小时内赤红球菌yc-yt1在不同温度条件下对dehp的降解率。10℃时，降解率可达为90％以上，说明菌株可耐受较低的温度条件，菌株所分泌的降解酶或许是低温启动温；随着温度升高至30℃，dehp降解率能达到最大值100％；当温度升高到40-50℃时，降解率有所下降，但降解率仍可达到90％以上，由此说明，菌株yc-yt1对温度的耐受范围很广，低温和高温条件均有较高降解率。

实施例3赤红球菌yc-yt1对含多种邻苯二甲酸酯废水处理中的应用

本实施例中使用含70g/lnacl的无机盐离子培养基(未灭菌)作为模拟废水(以下简称“废水”)，利用5.0l的发酵罐(bioflo115，newbrunswickscientificco.,nj,usa)进行模拟废水处理。将赤红球菌yc-yt1在lb液体培养基中培养至对数期(od600＝0.8，菌体浓度约为1.6×10⁸cfu/ml)，向废水中加入制备的菌液至终浓度分别为8×10⁷cfu/l、1.6×10⁸cfu/l、3.2×10⁸cfu/l、4.8×10⁸cfu/l、6.4×10⁸cfu/l和8.0×10⁸cfu/l废水(每个处理为2l废水)，并向废水中同时加入dehp、dprp、dbp、dop和bbp至各浓度为100mg/l，作为处理组；同时，以相同条件下加入相同浓度污染物底物且不接菌的废水作为对照组。搅拌转速为150rpm，通气比为0.8(空气)，培养温度为30℃。反应液ph值和溶氧量(do)通过反应器的操作系统监测。在处理的第7天取样测定各种底物浓度。对照组与处理组均进行3次重复。

取样方法：每次处理结束后，向发酵罐中加入2l正己烷，利用发酵罐的马达进行搅拌，1小时后静置30分钟(整个过程中关闭发酵罐所有管路)，取20ml上层有机相用于各底物浓度检测。根据最终测定处理组与对照组中底物的浓度计算菌株yc-yt1对废水中各底物的降解率。

赤红球菌yc-yt1对废水中各底物的降解率如表2所示，随着加入菌体量的增加各种底物的降解率逐渐提高，当接菌量达到4.8×10⁸cfu/l废水时，各底物的降解率基本达到最大值。

表2赤红球菌yc-yt1对废水中各底物的降解率

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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<110>中国农业科学院研究生院

<120>一种能够降解邻苯二甲酸酯的赤红球菌及其应用

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