一种特异性检测弓形虫核酸的荧光PCR方法和试剂盒与流程

本发明属于微生物体外核酸检测领域，具体涉及一种特异性检测弓形虫核酸的荧光pcr方法和试剂盒，能够对弓形虫的dna进行定性检测，可以作为有效的检测工具。

背景技术：

弓形虫病是由刚地弓形虫(toxoplasmagondii)引起的一种呈世界性分布且严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病。弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，能够感染人类和绝大多数的哺乳动物。据不完全统计，全世界约有三分之一成年人感染弓形虫。绝大多数受弓形虫感染的成人并不会导致严重的症状，但对于器官移植、恶性肿瘤、艾滋病等免疫缺陷者，以及孕妇等，弓形虫感染会导致一系列严重情况。弓形虫的一生同时需要终宿主和中间宿主来完成它的有性生殖和无性生殖。猫以及其他猫科动物是弓形虫的终宿主。弓形虫的主要感染途径为：一，口腔摄入感染；二，血液传播感染；三，先天性传播感染。先天性传播主要是母婴传播。值得注意的是，孕妇在怀孕早期感染弓形虫、会导致流产、死胎等情况，而在怀孕中后期感染弓形虫，则会导致胎儿发育迟缓，失明，脑炎，神经系统障碍等症状，是需重点解决的问题。

对于弓形虫的检测，临床实验室多采用血清学试验，如elisa、ria和ifa等，检测特异性抗体。血清弓形虫-igm阳性证明近期感染己持续2～4个月。血清弓形虫-igg阳性则提示既往感染。由于弓形虫抗原来源困难，血清学试验尚难普及，而且某些人群感染病毒后抗体反应很弱或不产生抗体，因此仅以抗体检测结果不能准确判定弓形虫感染情况，需辅以抗原或核酸检测结果作为诊断和治疗的依据。目前比较成熟的核酸检测方法是用荧光pcr方法，该方法克服了常规pcr法特异性差、易污染、结果分析操作步骤多等缺点，采用taqman方法或称双标探针法(荧光淬灭探针或称fq探针)，即在其5’端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。靶序列的特异性探针和特异性的pcr引物同时使用，设计的该探针在上下游pcr引物的范围内退火，由三个寡核苷酸共同结合于目的基因片段，使其特异性大大增强。在pcr的延伸阶段，taqdna聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性将荧光报告基团从探针上切割下来。随着pcr循环数的增加，游离报告基团的数量不断的增加，实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号，从而对靶序列进行定性分析。该pcr反应在封闭系统内进行，分析结果也无需开封，因此，避免了pcr产物污染的发生。

目前，也有荧光pcr方法用于检测弓形虫的报道，但是开发更多有效、快速、准确、灵敏度高、特异性强的荧光pcr方法用的引物和探针，并将此引物和探针用于检测试剂盒也是本领域追求的目标。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种特异性检测弓形虫核酸的荧光pcr方法及试剂盒，该试剂盒具有灵敏、特异、反应效率高的特点，能够实现定性检测弓形虫核酸的目的。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种特异性检测弓形虫核酸的荧光pcr试剂盒，包括特异性引物对和探针，所述的特异性引物对为：

正向引物：5’-ccgggtgaaacaatagagagtactg-3’；

反向引物：5’-ggtctacgtcgatggcatga-3’；

所述的探针为：5’-aacgtcgccgctactgcccagtt-3’。

本发明中，所述的探针的5’端标记报告荧光素或荧光染料，3’端标记淬灭基团。

具体地，所述的报告荧光素或荧光染料为fam或其它任何可以作为探针标记的荧光素或荧光染料；淬灭基团为tamra或其它任何可以作为淬灭基团的化学物质。

优选地，其它任何可以作为探针标记的荧光素或荧光染料例如hex、tet、joe、yakimayellow、cy3、cy3.5、cy5、ned、vic、pet、rox、liz、red、texasred；其它任何可以作为淬灭基团的化学物质例如dabcyl、bhq1、bhq2。

优选地，所述的试剂盒还包括阳性质控品，所述阳性质控品含人工合成序列，所述的人工合成序列为人工合成含所述弓形虫特异性引物对扩增产物片段的序列。该人工合成序列的内容为：

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根据一个实施方式，所述的阳性质控品是通过在puc57质粒载体中插入所述人工合成含所述弓形虫特异性引物对扩增产物片段的序列重组制得。

进一步地，所述的puc57载体质粒的浓度为1ng/μl。

优选地，所述的试剂盒还包括阴性质控品，所述阴性质控品含有人工合成的人类管家基因gapdh部分片段的特异性序列。

根据一个实施方式，用于扩增所述的人工合成人类管家基因gapdh部分片段的引物对如下：

正向引物：5’-cgggaaggaaatgaatgg-3’；

反向引物：5’-caaagggcaggagtaaag-3’。

根据一个实施方式，所述的阴性质控品为插入有所述人类管家基因gapdh的部分片段序列的ptg19-t载体质粒。

进一步地，所述的ptg19-t载体质粒的浓度为1ng/μl。

根据一个实施方式，所述阴性质控品所含的特异性序列为：

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本发明中，试剂盒还包括pcr反应液，所述的pcr反应液包括taq酶、dntp、缓冲液等成分。

本发明的另一个目的是提供一种特异性检测弓形虫核酸的荧光pcr方法，所述的荧光pcr方法采用所述的荧光pcr试剂盒。

本发明根据弓形虫b1基因的dna序列设计了特异性引物对和探针，探针采用荧光素标记，用荧光pcr仪对于待测的样本进行核酸的扩增，分析是否有该病毒核酸片段的扩增产物，从而达到检测该病毒的目的。

本发明中，所述的试剂盒的反应体系为20μl-50μl，如果是20μl体系，则包括：pcr反应液(2x)10μl，正向引物0.5μl(10μmol/ml)，反向引物0.5μl(10μmol/ml)，荧光探针0.5μl(10μmol/ml)，被检测物细胞、组织、体液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4μl，灭菌超纯水加至20μl；如果是50μl体系，则包括：pcr反应液(2x)25μl，正向引物1.25μl(10μmol/ml)，反向引物1.25μl(10μmol/ml)，荧光探针1.25μl(10μmol/ml)，被检测物细胞、组织、体液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4-10μl，灭菌超纯水加至50μl。

采用所述的试剂盒进行荧光pcr扩增的反应时间和温度为：50℃，2min1个循环(如果pcr反应液不含ung酶则省略)；95℃，2-10min(依据不同来源的pcr反应液而定)1个循环；95℃，15s，60℃，1min，40个循环并收集荧光信号。

由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明试剂盒通过对大量临床样本进行检测，能够有效检测出弓形虫，大量临床样本的检测也对试剂盒的有效性、大规模使用性提供了保障。

本发明试剂盒，弓形虫荧光pcr检测的反应效率高达88.5％，具有较高的反应效率。

附图说明

图1为弓形虫荧光pcr的反应图，图中从左至右的曲线分别对应阳性质控品的浓度从高到低；

图2为图1中弓形虫荧光pcr反应对应的标准曲线图；

图3为弓形虫荧光pcr引物对的质检电泳图，其中，1为弓形虫荧光pcr反应正向引物；2为弓形虫荧光pcr反应反向引物；m为电泳marker，长度由上到下依次为20，24，36(单位：碱基)；

图4为弓形虫荧光pcr探针的质检hplc图；

图5为puc57重组质粒构成示意图；

图6为ptg19-t质粒载体构成示意图。

具体实施方式

本发明的试剂盒采用自主设计的荧光pcr反应特异性引物对和荧光探针、人工合成的阳性质控品、人工合成的阴性质控品，具有灵敏度高、特异性强，反应效率高的特点，可以实现对弓形虫的定性检测，能够成为有效的辅助检测工具。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，应当说明一点，实施例仅用于具体说明本发明而不用于限制本发明。

实施例1：试剂盒的制备

1、特异性引物对和探针的设计和合成

使用primerexpress3.0软件，用弓形虫b1基因的dna序列设计特异性引物对和其特异性的探针，引物和探针均由上海捷瑞生物有限公司合成，在合成的探针上进行了荧光报告基团和荧光淬灭基团标记。其中，引物为page纯化，探针为hplc纯化。

设计出的特异性引物对和探针如下：

正向引物：5’-ccgggtgaaacaatagagagtactg-3’(seqidno.1)；

反向引物：5’-ggtctacgtcgatggcatga-3’(seqidno.2)；

探针为：5’-aacgtcgccgctactgcccagtt-3’(seqidno.3)。

引物和探针合成后均制备成冻干粉状，然后用1×tebuffer稀释至100μm的浓度作为母液，-20℃保存。工作液为母液通过无菌水稀释10倍制得，用于常规使用。

对特异性引物对和荧光探针进行质检分析，结果如图3和图4所示。

2、阳性质控品和阴性质控品的制备

阳性质控品的制备：含本发明的特异性引物对扩增产物的特异性序列片段由南京金斯瑞生物有限公司合成，然后用重组dna基因工程方法人工装入puc57质粒载体中，再通过转化大肠杆菌、质粒扩增和质粒提取等步骤获得重组质粒dna，此质粒dna就是本发明试剂盒中所使用的阳性质控品，该阳性质控品所含的特异性序列如seqidno.4所示。

阴性质控品的制备：是以人类管家基因gapdh基因为模板，设计常规pcr引物，引物序列如seqidno.5和seqidno.6所示，从人类组织细胞提取的基因组dna中进行pcr扩增，获得扩增产物，然后用重组dna基因工程的方法将扩增产物人工装配到ptg19-t质粒载体中，再通过转化大肠杆菌、质粒扩增和质粒提取等步骤获得重组质粒dna，此质粒dna就是本发明试剂盒中所使用的阴性质控品，该阴性质控品所含的特异性序列如seqidno.7所示。

3、pcr反应液

pcr反应液包括taq酶、dntp、缓冲液等成分，可以使用购自abi公司的荧光pcr反应混合液，名称是universalmastermixii,withung。

实施例2：样本核酸的提取

使用天根生化科技(北京)有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(dp304)，按照该试剂盒说明书的步骤，提取样本核酸。提取完成后，产物放-20℃保存。

实施例3：标准曲线的制作

选取阳性质控品作为标准物，稀释浓度至1μg/ml，然后继续以10倍梯度稀释五个浓度，一共是6个浓度梯度，即1μg/ml、10^-1μg/ml、10^-2μg/ml、10^-3μg/ml、10^-4μg/ml、10^-5μg/ml。然后将这六个浓度梯度的样本作为待测样本按照下述实施例4的反应体系和反应条件进行荧光pcr扩增反应，用与abi7500仪器配套的软件生成标准曲线。结果如图1和图2所示，且仪器的系统显示，反应效率达88.5％。

实施例4：荧光pcr扩增以及结果分析

1)荧光pcr扩增反应采用的反应体系如表1所示。在荧光pcr专用八联管中配置好每个体系后，放入abi7500荧光pcr仪器中(或其它类型的开放式荧光定量pcr仪器)，准备进行反应。每次实验都需要配置1个阳性质控品的反应管作为阳性对照和一个阴性质控品的反应管作为阴性对照。

表1

2)荧光pcr扩增反应采用的反应条件表2所示。

表2

3)结果分析：

(1)、反应结束后，首先，基线的选取设置为“自动”。阈值(threshold)设定的原则是阈值线刚好超过阴性质控品的扩增曲线的最高点，使其ct值＝40或“undetermined”。

(2)、设置好阈值后，观察阳性质控品的扩增曲线是否为正常的s型对数增长曲线，且ct值≤37。满足上述条件则说明本次实验反应正常，否则，需要重做。

(3)、结果判定。ct值≤37，表示该样本结果为阳性，ct值>37或“undetermined”，表示该样本结果为阴性。

应用实施例

使用本发明试剂盒对收集到的124例组织样本进行了检测。124例样本为临床收集的胎儿组织，分两组：正常引产组(对照组)42例，自发性流产组(患病组)82例。按照上述实施例2：样本核酸的提取。随后按照上述实施例4：荧光pcr扩增以及结果分析，使用本发明试剂盒在abi7500荧光pcr仪进行荧光pcr检测，胎儿组织中弓形虫荧光pcr检测结果如下表3所示。

表3

从表3中的结果可以得出，本发明试剂盒能够成功检测出弓形虫，并且从正常组和患病组的阳性率结果来看，本发明试剂盒可以很好地区分正常对照组和患病组,两者阳性率的比率是1比8.20,也就是说患病组弓形虫的感染率是正常对照组的8倍,结果显示本发明试剂盒具有很好的灵敏度和特异性，能够作为检测弓形虫的有效工具。大量临床样本的检测对试剂盒的有效性、大规模使用性提供了保障。

本发明试剂盒，弓形虫检测的反应效率高达88.5％，具有较高的反应效率。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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