核酸适配体‑多肽复合物探针及其制备方法和应用与流程

文档序号:11245022阅读:901来源:国知局
核酸适配体‑多肽复合物探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物与医药技术领域,具体涉及一种核酸适配体-多肽复合物探针及其制备方法和应用。



背景技术:

her2(也被称为neu、erbb-2、cd340和p185)是一种在her2阳性乳腺癌细胞中呈过表达状态的跨膜受体蛋白。her2的过表达可以增强癌细胞的侵袭性、生存能力和再生能力。到目前为止,许多证据表明早期诊断并及时辅以相应的治疗(如赫赛汀(曲妥珠单抗))能够很好地控制her2阳性乳腺癌的发展。

现有的一些技术如蛋白分子印迹(westernblotting)、酶联免疫吸附法(elisa)、免疫组织化学(ihc)、荧光原位杂交(fish)等能够检测到乳腺癌中her2的表达情况,其中用免疫组织化学(ihc)检测her2蛋白过表达以及用荧光原位杂交(fish)检测her2基因扩增已经通过了美国食品与药品监督管理局(fda)的审核认证。虽然所有这些方法都能提供关于her2表达水平的有价值的信息,但是这些大多数依赖于抗体的技术,限于抗体的局限性往往缺乏必要的特异性和可重复性,而且在her2基因没有扩增的情况下,her2蛋白也会存在过表达的情况。在这样的背景下,一种能在某些领域替代抗体作用的新型分子“核酸适配体”出现了,核酸适配体(aptamer)是通过selex技术(指数富集的配基系统进化技术)筛选出来的单链dna分子或rna分子,这类分子独特的三级结构使其具有易于合成、批次差异小、亲和力高、特异性好等特点。

近年来,几种以her2蛋白为靶标的核酸适配体陆续被筛选出来,其中,核酸适配体hb5是一种由86个核苷酸碱基构成的dna分子,它与her2蛋白胞外结构域上表位多肽结合的平衡解离常数(kd)值为18.9nm,与her2蛋白胞外结构域结合的平衡解离常数(kd)值为316nm。先前的研究也表明使用hb5比使用抗her2的抗体能观察到更强的膜染色,尤其是对于一些处理复杂的样品而言效果更明显。此外,与抗体相比,hb5对her2阳性乳腺癌细胞有着更好的选择性。然而,迄今为止发展出来的检测技术大多都依赖于荧光或者电化学传感平台。众所周知,荧光分子往往缺乏耐光性和足够的发射强度,而使用荧光的实验十分依赖于主观判断,这常常导致染色强度和程度的统一性判断仍处于较低水平。近年来,电化学检测已经展露出它的潜能,然而人们对于将核酸适配体固定在电极薄膜表面、微观环境对适配体结构的影响以及适配体-配体相互作用的认识研究仍然十分匮乏。更重要的是,大多数发展出来的方法提供的定量数据十分有限。

近年来,基于质谱的蛋白质组学技术在蛋白质分析领域越来越受欢迎,而作为公认的方法之一,基于液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)的定向蛋白质组学技术在定量蛋白时具有高灵敏度、高选择性以及较宽的动态范围的特点,这种技术实现定向分析的关键部分在于在多肽水平特异性检测和确定目标蛋白。通过目标蛋白的酶解得到能够代表目标蛋白的特征多肽,然后使用选择反应检测(srm)或多反应监测(mrm)来检测特征多肽,从而定量目标蛋白。然而,直接应用常规的定向蛋白质组学方法定量,如her2蛋白这样的跨膜蛋白,会遇到一些特殊的困难,这主要来源于膜蛋白的疏水性和对蛋白水解的天然抵制,此外较低的溶解度以及较低的酶解效率可能是另一个混杂因素。



技术实现要素:

解决的技术问题:本发明提供一种可用于检测乳腺癌细胞表面以及乳腺癌组织中her2蛋白含量的探针及其制备方法和应用。

技术方案:核酸适配体-多肽复合物探针,结构如下所示:

其中r1为核酸适配体,r2为底物多肽;

上述核酸适配体为hb5:

aaccgcccaaatccctaagagtctgcacttgtcattttgtatatgtatttggtttttggctctcacagacacactacacacgcaca

上述底物多肽为:

gdkavlgvdpfr。

核酸适配体-多肽复合物探针的制备方法,制备步骤为:按比例,以磷酸三氯乙酯为还原剂,100μl浓度为20μm的二硫键修饰的核酸适配体hb5与50μl的tcep还原珠混合,在37℃反应振摇2h;然后将样品1000×g离心5min;取上述制备的含有还原了的hb5的上清液,在上清中加入相同体积的200μm的马来酰亚胺修饰的底物多肽,37℃振荡4h进行共轭反应,使用高效液相色谱对反应产物进行纯化,去除多余的核酸适配体hb5和底物多肽。

上述核酸适配体-多肽复合物探针在制备检测乳腺癌细胞表面以及组织中her2蛋白含量产品中的应用。

检测乳腺癌细胞表面以及组织中her2蛋白含量的试剂盒,含有上述的核酸适配体-多肽复合物探针。

本发明通过使用一种新的核酸适配体-多肽复合物探针,定向蛋白质组学中特征多肽的思想可以被很好的保留下来。核酸适配体-多肽复合物探针是由核酸适配体和多肽两种分子共价结合形成的,核酸适配体可以紧密地结合her2蛋白,底物多肽包含报告多肽以及报告多肽前的胰蛋白酶切割位点。在酶切之后,报告多肽被释放并且最终使用液相质谱串联技术(lc-ms/ms)定量检测。通过这个方法,her2蛋白信号可以被转换成报告多肽的水平。需要特别指出的是,合适的底物多肽、报告多肽以及核酸适配体首次被应用于核酸适配体-多肽复合物探针的制备。在对新合成探针的结合效率、稳定性、亲和力、特异性和酶解效率进行表征之后,我们还对探针结合条件以及胰蛋白酶酶切条件进行了优化。最后,我们对准定向蛋白质组学方法进行了方法学验证,并将其应用于her2阳性乳腺癌细胞(bt474和sk-br-3)、her2阴性乳腺癌细胞(mda-mb-231和mcf-7)以及36对人类乳腺原发肿瘤组织及其对应癌旁组织中her2蛋白表达水平的检测。

有益效果:1)本发明所述的核酸适配体-多肽复合物探针,可化学合成,稳定性好;2)本发明首次将合适的底物多肽、报告多肽以及核酸适配体应用于核酸适配体-多肽复合物探针的制备;3)本发明所述的核酸适配体-多肽复合物探针制备方法简单易行,利用的是多肽氨基端修饰的马来酰亚胺与核酸适配体5’末端修饰的巯基发生迈克尔加成反应,属于共价连接,反应速率高,耗时短,产物的纯度和产率较高,可直接用于细胞和组织试验;4)本发明所述的核酸适配体-多肽复合物探针与her2表位肽有较好的亲和力,能够特异性识别her2表位肽以及乳腺癌细胞和组织上的her2蛋白;5)本发明首次将核酸适配体技术与定向蛋白质组学技术结合,将核酸适配体识别靶标的高特异性、高亲和力与定向蛋白质组学技术检测的高灵敏度、高选择性以及较宽的动态范围结合起来,发展了一种全新的准定向蛋白质组学定量方法。6)本发明所述的准定向蛋白质组学定量方法能准确检测her2阳性乳腺癌细胞(bt474和sk-br-3)以及her2阴性乳腺癌细胞(mda-mb-231和mcf-7)表面的her2蛋白含量。7)本发明所述的准定向蛋白质组学定量方法能准确定量乳腺癌组织切片上的her2含量,客观的定量数据很好地弥补了传统免疫组织化学ihc判定的主观性,具有发展成为her2阳性乳腺癌精确诊断依据的潜力。8)本发明所述的准定向蛋白质组学定量方法理论上可以定量绝大多数类型的细胞膜蛋白,前提是能筛选出目标膜蛋白对应的核酸适配体以及优化对应的反应条件。

附图说明

图1为本发明中核酸适配体-多肽复合物探针的制备及其与准定向蛋白质组学结合检测her2蛋白新方法的流程示意图;

图2为本发明中报告多肽avlgvdpfr及其对应同位素内标多肽av*lgv*dpfr的lc/ms/ms图谱,其中a:报告多肽avlgvdpfr的子离子图谱;b:报告多肽avlgvdpfr的液相色谱质谱联用色谱图以及相应同位素内标的色谱图;

图3-1为本发明中合成核酸适配体-多肽复合物探针的原理图;

图3-2为预测的核酸适配体hb5的二级结构图;

图4-1为本发明中核酸适配体hb5和底物多肽gdkavlgvdpfr在反应前后的高效液相色谱图,其中a:核酸适配体hb5和底物多肽gdkavlgvdpfr在反应前和反应后在dna的紫外吸收波长260nm处的高效液相色谱图;b:核酸适配体hb5和底物多肽gdkavlgvdpfr在多肽的紫外吸收波长220nm处的高效液相色谱图;

图4-2为本发明中核酸适配体-多肽复合物以及单独的核酸适配体用lcqdecaxpplus离子阱质谱在电喷雾正离子模式下检测得到的质谱图,其中a:核酸适配体电喷雾离子源质谱图;b:核酸适配体-多肽复合物探针电喷雾离子源质谱图;

图4-3为本发明中核酸适配体-多肽复合物探针在酶切前和酶切后的高效液相色谱图和液质联用色谱图,其中a:核酸适配体-多肽复合物探针在酶切前和酶切后于dna紫外吸收波长260nm处的高效液相色谱图;b:核酸适配体-多肽复合物探针在酶切前和酶切后于特征mrm通道m/z487.3→m/z419.3上的液相色谱质谱联用色谱图;

图5-1为本发明中核酸适配体-多肽复合物探针在37℃的稳定性;

图5-2为本发明中核酸适配体-多肽复合物探针以及fitc荧光修饰的核酸适配体hb5对her2表位肽(incthscvdlddkgcpaeqr)的亲和力实验;

图6为本发明中阐述的新方法所使用的her2表位肽标准品的标准曲线(从10pm到100nm);

图7为本发明酶切过程中,胰酶的浓度和酶切时间对细胞活性的影响考察实验,其中a:sk-br-3细胞的显微镜下图;b:bt474细胞的显微镜下图;c:温度37℃、反应时间30min不变,逐步升高胰蛋白酶浓度时细胞的活性变化;d:温度37℃和胰酶浓度10μg/ml不变,观察0-120min经历不同反应时间细胞活性的变化;

图8-1为使用本发明中阐述的新方法检测得到的her2阳性乳腺癌细胞bt474和sk-br-3以及her2阴性乳腺癌细胞mda-mb-231和mcf-7中her2蛋白的表达水平;

图8-2为her2抗体赫赛汀对本发明中核酸适配体-多肽复合物探针检测her2时的竞争性抑制效果;

图9为使用本发明中阐述的新方法检测36对乳腺组织切片样品中her2蛋白的表达量,其中癌旁正常组织只展示了与her2(3+)乳腺癌组织对应的癌旁组织的数据;

图10为典型的her2阴性、her2(+)、her2(2+)和her2(3+)乳腺肿瘤的免疫组织化学图,以及对应的用本发明阐述的新方法检测得到的多肽质谱响应图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1核酸适配体-多肽复合物探针的合成及鉴定

(1)核酸适配体-多肽复合物探针的制备和纯化

以磷酸三氯乙酯(tcep)为还原剂,100μl浓度为20μm的二硫键修饰的核酸适配体hb5

(aaccgcccaaatccctaagagtctgcacttgtcattttgtatatgtatttggtttttggctctcacagacacactacacacgcaca)与50μl的tcep还原珠混合,在37℃反应振摇2h。然后将样品1000×g离心5min。取含有还原了的hb5的上清液,在上清中加入相同体积的200μm的马来酰亚胺修饰的底物多肽(gdkavlgvdpfr),37℃、剧烈振荡4h进行共轭反应,紧接着利用共轭前后保留时间的不同(核酸适配体以及核酸适配体-多肽复合物的保留时间分别是14.0min和16.9min,如图4-1a)使用半制备的高效液相色谱对反应产物进行纯化,去除多余的未反应hb5和底物多肽,纯化后产物的纯度通过hplc进行纯度鉴定,纯度在98%以上。为了排除由于肽段共出峰可能造成的干扰,其余条件不变,用检测肽段的波长(220nm)对核酸适配体-多肽复合物进行检测,如图4-1b所示,肽段没能从色谱柱中洗脱出来。

(2)核酸适配体-多肽复合物探针的结构鉴定

新合成的核酸适配体-多肽复合物首先经过lcqdecaxpplus离子阱质谱分析进行验证(如图4-2),核酸适配体增加的分子量与底物多肽的分子量相匹配。新合成的探针还通过用胰蛋白酶酶切来表征,酶切释放的核苷酸和多肽分别用高效液相色谱(hplc)和液相质谱联用(lc-ms/ms)进行检测。正如预期的那样,在酶切之后出现了新的色谱峰(如图4-3)。需要指出说明的是新色谱峰的保留时间(如hplc上的8.81min以及lc-ms/ms上的3.28min)与用于共轭反应的核酸适配体的保留时间(14.0min)以及底物多肽的保留时间(3.07min)不完全一致。保留时间的迁移主要是由于三个氨基酸残基从底物多肽上脱落,并装载到了核酸适配体上。所以,实际上酶切后我们检测到的是hb5-gdk和avlgvdpfr(报告多肽)。最后测得核酸适配体-多肽复合物探针的酶切效率为94.38±1.49%,与底物多肽单独酶切的效率(95.8±2.6%)相比,差别无统计学意义,表明探针的核酸部分不会对胰蛋白酶的酶切产生影响。

(3)核酸适配体-多肽复合物探针的性质鉴定

a)稳定性

将约200μl制备好的核酸适配体-多肽复合物探针(约2μm)加入到200μl的结合缓冲液中,结合缓冲液的成分是磷酸盐缓冲液(pbs)外加5mmmgcl2、4.5g/l葡萄糖、0.1mg/ml鲑鱼精dna和1mg/ml牛血清蛋白。混合物在37℃反应12个小时,并用高效液相色谱在0h、0.5h、1h、2h、4h、8h和12h七个时间点监测探针浓度。如图5-1所示,在37℃条件下孵育12h对探针稳定性的影响微乎其微。

b)亲和力

200μl的珠子加入到200μl包含100μm的生物素化her2表位肽的pbs中,在37℃孵育振摇2小时。用pbs冲洗三次后,将珠子与各种不同浓度的核酸适配体-多肽复合物探针(200μl的结合缓冲液中含有5nm、10nm、20nm、40nm、80nm、160nm的探针)在37℃中孵育2.5h。然后,用500μl的pbs冲洗三遍去除未结合的探针,通过胰蛋白酶酶切结合了探针的珠子,使报告多肽释放出来,用质谱检测响应。使用以下方程计算kd值:y=bmaxx/(kd+x),其中x是加入探针的浓度,y是计算出来多肽的含量,bmax是最大结合容量。如图5-2所示,测得核酸适配体-多肽复合物探针对靶标her2表位肽的平衡解离常数(kd)值为64.1nm,与单独核酸适配体对her2表位肽的kd值29.5nm相比,亲和力下降了2.2倍,但这个亲和力水平还是能够满足分析要求的。

实施例2用核酸适配体-多肽复合物探针检测乳腺癌细胞表面的her2蛋白含量

为了防止对细胞表面的蛋白质造成损伤,我们使用无酶细胞消化液分别收集状态良好的her2阳性乳腺癌细胞(bt474和sk-br-3)以及her2阴性乳腺癌细胞(mda-mb-231和mcf-7)。细胞在pbs冲洗三次后,用200μl的结合缓冲液进行封闭,封闭温度37℃,时间30min。然后在细胞数约为1×106的细胞中加入200μl的浓度为1μm的探针,混合物在37℃中振摇反应2.5小时。反应结束后用500μl冷的pbs冲洗细胞三次洗去未结合的探针,再用100μl浓度为50mm的碳酸氢铵溶液冲洗细胞两次。然后用表层酶切(或限制性酶解)技术主要用于从生物样品中释放报告多肽,对于已经结合了探针的细胞样品,将测序级的胰蛋白酶与细胞悬液(约106个细胞)在最佳条件下孵育,然后样品被转移到冰上,用离心机2,000×g,4℃离心10min。取上清放入新的管中,用20,000×g,4℃离心10min。取上清,在上清中再加入2μg胰蛋白酶,然后让样品在37℃反应24h。通过加入10μl的浓度0.1%的三氟乙酸溶液终止酶切反应,然后加入20μl浓度为5nm的内标溶液。接着将混合物转移到一个微型c18除盐柱中,除盐柱预先使用100μl的乙腈和100μl的水进行活化,装载了样品中的多肽之后,用100μl含有0.1%三氟乙酸的5%乙腈溶液冲洗,再用100μl的含有0.1%甲酸的80%乙腈溶液洗脱装载的多肽,最后进行质谱检测。

胰蛋白酶的浓度和酶切的时间都经过了调整优化,具体来说,我们评估了10min到120min里5个时间点以及5μg/ml到100μg/ml之间6个浓度点,结果表明,在20μg/ml胰蛋白酶浓度条件下孵育30min,活细胞数目仍能保持在一个稳定的水平(见图7)。

用本发明中的准定向蛋白质组学方法测得her2蛋白在bt474细胞中的准确含量为(8.37±2.19)×105/cell,在sk-br-3细胞中含量为(7.86±1.57)×105/cell,在mcf-7细胞中含量为(0.47±0.14)×105/cell,在mda-mb-231细胞中含量为(0.45±0.08)×105/cell(见图8-1)。为了进一步证明这种准定向蛋白质组学方法的定量能力,我们用赫赛汀(曲妥珠单抗)进行了her2蛋白竞争性结合实验。赫赛汀是一种人源的单克隆抗体,与核酸适配体hb5一样,能够结合在her2蛋白胞外结构域的第四区域,所以它可以在一定程度上竞争性地抑制核酸适配体hb5与her2蛋白的结合。如图8-2所示,用赫赛汀进行预处理之后,有效封闭了结合位点,抑制了核酸适配体-多肽复合物探针与her2的结合。意料之中的是少量的her2仍然能够被检测到,这是由于结合位点空间位阻作用导致的,这种作用限制了抗体结合抗原的数量,造成了不完全封闭。相比之下,预先用过量胰蛋白酶处理可以完全去除her2表位肽,也就检测不到信号了。

实施例3用核酸适配体-多肽复合物探针检测乳腺癌组织切片上的her2蛋白含量

将36对人类乳腺原发肿瘤组织及其对应癌旁组织放在事先用100%的酒精和100%的甲醇处理过的冻结切片机上切成6μm的组织切片,将200μl的结合缓冲液滴在组织切片上,于37℃轻微摇晃1h,之后用结合缓冲液冲洗组织切片三遍。然后,加入200μl含有200pmol探针的结合缓冲液,在37℃孵育2.5h。最后,组织切片用pbs冲洗三遍,用浓度为50mm的碳酸氢铵溶液冲洗两遍。用胰蛋白酶与装载了探针的切片进行孵育,用离心管收集反应后溶液。在20,000×g,4℃离心10min之后,在离心管中加入2μg的胰蛋白酶,然后在37℃环境下反应24小时,加入10μl的0.1%三氟乙酸溶液终止酶切反应。最后,在样品中加入20μl的内标溶液进质谱检测。

图9展示了用本发明所述的准定向蛋白质组学方法检测的结果,我们也用免疫组织化学检测对每个组织样本进行0~3+的评分(如图10),双向的曼-惠特尼(mann-whitney)检验显示除了her2(2+)组和her2(3+)组之间没有统计学差异之外,其他各组之间均有统计学差异(p<0.005)。检测可知正常癌旁组织中her2的参考值范围是5.30(90%ci,3.61-6.99)nmol/m2到12.0(90%ci,10.3-13.7)nmol/m2,而癌组织her2-、her2+、her2++、her2+++四组中分别有9个、2个、1个、0个样本的检测结果在正常值范围内,表明免疫组织化学这种检测方法存在假阳性结果的问题。而用本研究的准定向蛋白质组学定量方法则能使测得的数据更加精确,更能满足精确诊断的要求,更容易应用于her2评分参考范围的建立以及进一步的分层。

以上实例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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