一种植物干旱诱导型人工合成启动子SP2及应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种植物干旱诱导型启动子sp2及其在转基因植物中的应用。

技术背景

启动子通过与一种或多种转录因子结合而调控基因的表达。每个启动子都有其特定的序列结构和结合位点，启动子的主要结构包括核心启动子序列和上游启动子元件，可以指导附近dna区段的转录。启动子在基因转录的起始和调节中发挥非常重要的作用，在基因工程中是重要的组成构件。近年来，随着合成生物学的发展，人工合成功能元件在代谢工程领域显示出巨大应用潜力。细胞的代谢通量主要受到转录水平的调控，而启动子是转录水平的重要调控元件，因此，启动子被列为合成生物学的重要功能元件之一。

顺势作用元件是核心启动子上游的一段序列，通过与转录因子结合调节基因转录起始频率和转录效率。启动子末端和近端的顺式调节序列的排列和组合，与特定的反式作用因子结合时，可以调节相邻的编码蛋白质基因的表达。核心启动子不仅是基础转录的关键因素，对于调节转录和组织特异性也特别重要。通过设计核心启动子序列上游的顺式作用元件来调节启动子的活性，可以驱动目的基因按照所需要的特性表达，比如能够在特定的位点和时间调节基因表达的水平。植物中通过组合某些顺式作用元件并连接一个核心启动子构建诱导型启动子，能够使报告基因在受到信号刺激时直接表达。

干旱、盐碱、低温等逆境胁迫严重影响作物的生长和产量。通过胁迫诱导型启动子驱动转录因子，进而激活多个逆境诱导基因的表达，是提高作物抗逆性的一个有效手段。然而，目前分离和鉴定的天然启动子的活性都受到一定限制，比如低表达活性和低特异性等。因此，开发和应用高活性的人工合成启动子，实现对基因的精细调控，具有重要的科学和现实意义。本专利公开了一种人工设计合成的植物逆境诱导型启动子，该启动子对干旱胁迫极为敏感，也可以受盐、盐碱、aba以及低温胁迫诱导而驱动报告基因gus表达。

技术实现要素：

本发明的目的是为了实现对基因的精细调控，而提供一种植物干旱诱导型启动子sp2。

一种植物诱导型启动子sp2，它的核苷酸序列如seqidno.1所示。

一种植物表达载体，它是在植物表达载体中插入了如seqidno.1所示的核苷酸序列；

所述的植物表达载体为pbi121。

含有seqidno.1的互补及反向序列。

一种大豆诱导启动子sp2在以干旱或盐碱为选择压力的选择标记方面的应用。

一种大豆诱导启动子sp2在培育抗干旱或耐盐碱转基因植物的应用；

所述的的植物为单子叶植物或双子叶植物。

本发明提供了一种大豆诱导启动子sp2，属于人工合成启动子构建，它是以g-box、abre、abf、sorlip1、cca1、e2f为基本顺式元件，每个元件串联重复4次，两元件中间以7-9个碱基的随机序列间隔，将以上设计片段再与35s核心启动子corecamv35s连接构建而成，命名为，简称为sp2。该启动子是下述核苷酸序列之一：1）序列表中seqidno.1的dna序列；2）与序列表中seqidno.1限定的dna序列具有90%以上同源性且具有启动基因转录功能的核苷酸序列。在转基因烟草中鉴定sp2启动子驱动报告基因gus的表达情况表明，sp2启动子可以受干旱、盐、盐碱、aba以及低温胁迫所诱导，对干旱胁迫极为敏感。本发明人工设计构建了一种植物干旱诱导型启动子sp2，可直接应用于农作物转基因抗逆育种。

附图说明：

图1为sp2与gus融合表达载体图；

图2为转sp2基因烟草在不同胁迫条件下gus蛋白的染色情况；

图3为转sp2基因烟草在不同胁迫条件下gus蛋白的活性。

具体实施方式：

实施例1.植物逆境诱导型启动子sp2的设计

通过将大豆逆境转录组测序数据与genbank中已有大豆逆境表达谱数据相结合，筛选出受干旱调控的目的基因63个，然后将它们列表进行cluster模块分类。获得4个cluster后，利用motif鉴定软件分别对每个cluster进行motif的鉴定，最终获得46个与逆境调控相关的启动子共有表达元件。选择其中的g-box、abre、abf、sorlip1、cca1、e2f为基本顺式元件，每个元件串联重复4次，两元件中间以7-9个碱基的随机序列间隔，将以上设计片段再与35s核心启动子corecamv35s连接构建而成syntheticpromoter2，简称为sp2，其核苷酸序列为seqidno.1序列。

实施例2.启动子sp2表达载体的构建

通过人工合成方法将sp2（seqidno.1）序列合成到载体puc57上，并在序列两端添加酶切位点bamhl和hindiii。将puc57-sp2载体和pbi121质粒，分别用bamhl和hindiii进行双酶切，分别回收酶切产物后，经连接、转化、鉴定，获得表达载体pbi121-sp2（如图1）。将载体pbi121-sp2转化至农杆菌eha105中，用于浸染烟草。

实施例3.转sp2基因烟草的获得

按照叶盘转化法（horschetal.1988）进行。农杆菌菌液用灭菌水稀释至106-107cells/ml（一般稀释30倍左右）。取无菌烟草叶片，去掉主脉将叶片切成四方形状，然后将其浸入到稀释后的菌液中，侵染8-10分钟。

1)共培养

取出叶片外植体后在灭菌滤纸上吸干菌液，将其叶表面向下倒置于ms培养基的表面，24°c-25°c暗培养2天。

2)选择培养

将共培养叶片转移到选择分化培养基（含250mg/l头孢；100mg/l卡那霉素）上，28°c，每日光照16小时，15-20天换一次培养基。

3)生根培养

当分化的抗性芽长到1cm左右，切下（最好不带任何愈伤组织）转移到生根培养基上，28°c，每日光照16小时。

4)土壤培养

当根长出约1-3cm长，且密度较大时，去除封口膜，室温环境中进行炼苗2-3天，取出植株彻底洗净培养基，同时注意尽量减少根的损伤，移入温室土壤中培养。前2-3天需要遮阴培养。

5)烟草的繁种

将转基因烟草播种与人工气候室中，繁种至t2代后，收取种子用于gus染色分析。

实施例4gus组织化学染色

将转sp2基因烟草种植于ms固体培养基中，待长至4片叶时将小苗移至液体培养基中，生长2天后进行盐、盐碱、干旱、低温及aba处理，干旱处理1天，其他处理均处理6小时。将处理好的烟草幼苗置于固定液（1%甲醛，50mm磷酸钠缓冲液ph7.0，0.05%tritonx-100）中，室温静置固定45-60min；然后用50mm，ph7.0的磷酸钠缓冲液漂洗2-3次，每次10-15min；加入x-gluc染色液浸没材料，盖上管盖，37℃避光保温过夜。弃去染色液，50mm，ph7.0磷酸钠缓冲液漂洗冲洗后，加入25%、50%、75%、90%、100%的梯度浓度乙醇分别浸泡1h进行脱色，体视显微镜下观察并拍照记录gus的表达情况。结果显示（如图sp2启动子驱动的gus基因在盐、盐碱、干旱、aba以及低温等处理下均有表达，其中干旱胁迫下gus染色较深，而未经处理的转基因烟草中gus没有表达，并且gus基因在烟草的各组织中均有表达。这些结果说明sp2启动子为诱导型启动子，可以受盐、盐碱、干旱、低温以及aba处理所诱导，并且受干旱胁迫诱导显著，适合作为利用植物基因工程手段培育抗逆作物新品种的候选启动子。

实施例5gus活性测定

1gus酶提取

1)将0.1g的转基因烟草材料置于研钵中，加入液氮研磨成粉末；

2)加入600µl的酶提取缓冲液，研磨成匀浆；

3)4℃，12000rpm离心10min，取上清，-20℃保存备用。

法测定gus提取液的蛋白含量

1）制作标准曲线：配置浓度0-100µg/ml的bsa梯度液（表1），与考马斯亮蓝g250按照1：5混匀，室温静置5min，595nm测量吸收值，以吸收值作纵坐标，蛋白浓度为横坐标做回归方程；

2)提取液蛋白含量的测定：取gus提取液20µl，加水至4ml，取出1ml，加入5ml考马斯亮蓝溶液混匀，595nm测量吸收值，根据回归方程计算样品中蛋白含量。

荧光测定

1）制作标准曲线：配制10µm4-mu母液，用反应终止液将其稀释成依次为：62.5nmol/l，125nmol/l，250nmol/l，500nmol/l，1000nmol/l的浓度，用荧光分光光度计在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下测定各管荧光强度，制作一条标准曲线；

2）取6支1.5ml的离心管，各加入900µl的反应终止液，并编号；

3）取1支1.5ml的离心管，加入37℃预热的检测液2mmol/lmug1ml，根据测定蛋白的浓度加入适量的gus提取液，迅速充分混合，立即取出100µl加入1号管中，此时反应为0，严格计时；

4）反应管放入37℃水浴中进行酶反应，分别于5、10、15、30、60min时各取出100µl加入到900µl反应终止液，依次加入到2-6号管中混匀，分别为酶反应5、10、15、30、60min时的样品，在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下测定各管荧光强度，并从标准曲线上读取2-6号管中4-mu的含量。

酶活性计算

l)酶活力单位定义：每分钟水解4-mug生成1nmol或1mg、1µg、1ng4-mu的酶量为一个活力单位，根据定义求出各样品的酶活力；

2)gus基因表达活性：以每毫克蛋白的酶活力来计算，每毫克蛋白每分钟催化生成1pmol4-mu作为gus的一个活力单位。

gus荧光检测的gus活性用获得的荧光值除以蛋白浓度和时间得到相对活性。荧光测定结果（如图3）显示，未处理的转sp2基因烟草荧光值较低；不同胁迫处理条件下，转基因烟草的gus荧光值均有所提高，其中干旱胁迫下提高的尤为显著，约为未处理的8倍左右。这就表明，sp2启动子为胁迫诱导型启动子，能够在胁迫条件下驱动gus基因表达而使对应的荧光值提高。

<110>吉林农业大学

<120>一种植物干旱诱导型人工合成启动子sp2及应用

<160>1

<210>1

<211>429

<212>dna

<213>人工

<400>1

cacgtgacgtcgtcacgtgccctttcacgtgagagagcacgtgtatatatacgtggcagc60

tagctacgtggcatttcatacgtggcagcgcgctacgtggcgagagacacgtggctagta120

caccacgtggctgcatgcacacgtggcgacgactgacccacgtgggctagctgctacgta180

gcccacgtgggcgcgataccacgtgggtctcgtccacgtggacgctaacccagccacagc240

tacaagccactgactagcatgcagccacgcactatcgagccactgtgtactaaaaaaaat300

ctatgatagtagcacaaaaaaaatctatgacgtgcagcaaaaaaaatctatgatatatat360

atgcaaaaaaaatctatgagatcccaagacccttcctctatataaggaagttcatttcat420

ttggagagg