一种SD大鼠感染人附红细胞体模型的构建方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种sd大鼠感染人附红细胞体模型的构建方法。

背景技术：

人附红细胞体病(humaneperythrozoonosis，he)是由附红细胞体(eperythrozoon)感染引起的人兽共患性传染病。主要临床表现是发热、贫血、乏力、出汗、脱发，关节疼痛，严重时出现黄疸，肝脾肿大等，临床症状呈多样性，多数患者有发热、贫血症状。该病广泛存在于许多国家和地区，多发于夏秋季节，条件性致病，具有感染率高，发病率低的特点，免疫力低下时易发病。一般认为接触传播、血源传播、垂直传播、以及昆虫媒介传播等，都为可能的传播途径。垂直传播已在临床中得到证实。附红细胞体感染后是否发病，由个体的免疫状态决定。病变主要在肝、脾、淋巴结，也可累及心肺。诊断主要以在血液中查出附红体并伴有发热、贫血、乏力、关节肿大等典型表现并结合其职业、居住地区等进行综合判断。目前临床治疗人附红细胞体病的药物种类繁多，有四环素类(土霉素、四环素、强力霉素等)、氨基糖苷类(丁胺卡纳、庆大霉素等)和抗原虫药物青蒿霉素等，多数用药后可控制临床症状，但易复发。

根据现有的文献资料以及临床病例报道，虽然本病发病机制尚未清楚，但贫血作为附红细胞体病的特征性临床表现已经很清楚，且已研究显示附红细胞体病引起的贫血是溶血性贫血，这种溶血包括血管内溶血、血管外溶血以及自身免疫性溶血等。但其发生血管内溶血、血管外容血、自身免疫性溶血的具体机制尚未见报道。

文献中已报道的附红细胞体病的血液学检测结果表明附红细胞体病时血常规检查一般可见红细胞计数降低、红细胞压积降低、血红蛋白浓度下降、白细胞计数增多。但是人附红细胞体病时这些指标是如何发生变化的，这种变化是否存在波动和反复，尚未见相关的实验研究和临床报道。

红细胞膜上的na⁺-k⁺-atp酶是一种mg依赖的na、k激活的对鸟苯苷敏感的别构酶，它在维持内环境稳态中起了重要作用，生理情况下它通过维持膜电位、控制细胞内外的离子成分、调节、控制消化产物的跨上皮吸收等在离子转运系统中起主要作用。附红细胞体感染时，附红细胞体主要寄生在红细胞表面，是否会影响红细胞膜表面该酶的活性，从而对机体能量代谢产生影响，未见实验报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种sd大鼠感染人附红细胞体模型的构建方法。根据已知的附红细胞体的生物学特性可成功的将人附红细胞体从红细胞上、血浆中分离出来，获取的分离纯化液以100ul/只的量经腹腔注射的方式能感染sd大鼠，成功建立人附红细胞体病sd大鼠感染模型。模型组大鼠的感染率随着感染时间的增加呈先增加后降低的变化，说明人体感染附红细胞体后附红细胞体与红细胞以及机体本身存在剧烈的相互作用。

其具体技术方案为：

一种sd大鼠感染人附红细胞体模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤1、附红细胞体感染率计算及感染情况分度

在血涂片的头、体、尾部各随机选取3个视野，每个视野计数200个红细胞，计数200个红细胞中被附红体感染的红细胞的个数，被感染红细胞的总数与红细胞总数的比值再乘以百分之百，即为该张血片的感染率，每张血片，重复计数三次，并取其平均值作为最终感染率，其中感染划分为3个程度：低于30％为轻度感染，30％-60％为中度感染，高于60％为重度感染；

步骤2、人附红细胞体分离纯化；

步骤3、瑞氏染液配制

(1)把瑞士染粉1.2g，加入研钵，研成粉末；

(2)加入甘油80ml；

(2)加入甲醇600ml，常温下放置3个月；

步骤4、瑞士缓冲液配置

(1)取1％磷酸二氢钾30ml，1％磷酸氢二钠20ml，加蒸馏水至1000ml.

(2)调整其ph在6.4-6.8，121℃高压灭菌30min，封口放4℃冰箱备用；

步骤5、阿氏液配制

(1)取葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.80g，加蒸馏水至100ml；

(2)将ph调至6.1，过滤后分装；

(3)121高压灭菌30min，封口放4℃冰箱备用；

步骤6、瑞士染色

(1)感染的第1、3、5、7、9、11d上午8:30从大鼠尾静脉采血进行瑞士染色；

(2)血涂片平置于染色架上，根据血膜大小滴加适量瑞氏染液，3～5滴，使其迅速盖满血膜；

(3)加染液一倍量的缓冲液，用洗耳球对准血涂片，使染液与缓冲液充分混合，染色10min，以固定血片；

(4)水洗30s，待自然干燥后，经油浸物镜光学显微镜检查计数其感染率并观察红细胞大小、形态、颜色；

步骤7、sd大鼠感染人附红细胞体模型的构建

(1)将准备好的人附红细胞体分离纯化液经腹腔注射的方式进行接种；

(2)模型组大鼠每只注射100ul分离纯化液，对照组大鼠每只腹腔注射100ul无菌生理盐水注射液；

步骤8、体温测量

在实验期间的0、3、5、7、9、11天，每天上午八点，用电子体温计测量大鼠体温；

步骤9、临床症状观察

在实验期间的0、3、5、7、9、11天，每天上午八点在测量相关指标的同时观察大鼠的精神状态、饮食饮水情况、皮肤、巩膜有无黄染、脱毛严重与否；

步骤10、数据处理

用重复测量方差分析方法分析感染率，检验水准采用a＝0.05，实验结果用均数±标准差进行统计描述，图表中a表示与对照组相比，差异具有统计学意义，p＜0.05：b表示与模型组自身第0天对比，差异具有统计学意义，p＜0.05；c表示与模型组自身第3天对比，差异具有统计学意义，p＜0.05；d表示与模型组自身第5天对比，差异具有统计学意义，p＜0.05。e与模型组自身第7天对比，差异具有统计学意义，p＜0.05；进一步，步骤2中，人附红细胞体分离纯化的具体步骤为：

(1)取筛选好人附红细胞体重度感染患者edta抗凝血，2000转/分钟，离心10分钟，弃去上清；

(2)在所剩的红细胞泥中加入等体积阿氏液垂悬红细胞悬液；

(3)然后将其转移置新的大号离心管中，加入等体积的淋巴细胞分离液，2500转/分钟离心20分钟；

(4)弃去白细胞层，将红细胞泥用等体积的阿氏液垂悬，50c水浴30分钟，使附红细胞体与红细胞分离；

(5)2000转/分钟离心30分钟，弃去上清，所得沉淀垂悬于适量的阿氏液中，并用血细胞计数板将浓度调整为1.10⁷个/ul此时用显微镜观察，视野中可见运动中的、大小不一的附红细胞体。

进一步，步骤7中分离纯化液的浓度为1.10⁷个/ul。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明在附红细胞体病动物模型构建方面，经过反复的预实验，最终选取sd大鼠作为实验动物，与现有技术中选用小鼠作为实验动物相比较，大鼠具有体型大小合适、采样方便、血量相对充裕的优点，可以克服小鼠血量少，不能满足实验过程反复测量某些指标的弊端。实验中采用腹腔注射的方式感染sd大鼠，相对于采用尾静脉注射感染方式而言，操作简便，容易复制动物模型。对于分离纯化液的注射量，经过预实验摸索及正式实验验证，100ul即可成功感染大鼠。

附图说明

图1是人附红细胞体重度感染患者血液样本瑞士染色血涂片(10x100oil)，其中，

图1a为无人附红细胞体感染血液样本瑞士染色血涂片：可见表面光滑、细胞膜完好的淡红色细胞(10x100oil)；图1b为附红细胞体重度感染患者瑞士染色血涂片：图中可见红细胞被具有明显折光性的棕褐色的小体附着(10x100oil)；

图2是人附红细胞体重度感染患者血样分离纯化液光镜下图片(10x100oil)，其中，

图2a为人附红细胞体分离纯化液(调焦前)：可见以棕褐色圆形小体为主的附红细胞体；

图2b为人附红细胞体分离纯化液(调焦后)：可见其具有明显的折光性；

图3是模型组大鼠瑞士染色血涂片，图3a-图3f依次为感染0、3、5、7、9、11d(10*100oil)；

图4是照组大鼠瑞士染色血涂片，图4a-图4f依次为感染0、3、5、7、9、11d(10*100oil)；

图5是人附红细胞体病sd大鼠感染率计数结果。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

spf级sd大鼠30只，6w，雌雄各半，购自北京维通利华动物公司，许可证号为scxk(京)2012-0001。动物进入动物饲养中心后立即经尾静脉采血，血涂片瑞士染色，经油镜观察有无附红细胞体感染。确定无附红细胞体感染后，饲养于内蒙古医科大学动物中心屏障系统，用随机数字表法将所有动物分为两组，模型组、对照组。两组分开饲养：模型组(大鼠1021室)，对照组(大鼠1023室)，饲养条件为：温度18～29℃；湿度30％～40％，饮用高压灭菌水，食用spf级鼠粮。

1.1.2人附红细胞体病重度感染患者血液样本筛选

人附红细胞体血液样本来源于内蒙古医科大学第二附属医院入院患者，静脉无菌采集抗凝血，经血涂片瑞士染色，油浸物镜(10×100)检查其附红细胞体感染情况，筛选重度感染患者血样备用。

1.2方法

1.2.1附红细胞体感染率计算及感染情况分度

在血涂片的头、体、尾部各随机选取3个视野，每个视野计数200个红细胞，计数200个红细胞中被附红体感染的红细胞的个数，被感染红细胞的总数与红细胞总数的比值再乘以百分之百，即为该张血片的感染率。为减少误差，每张血片，重复计数三次，并取其平均值作为最终感染率。其中感染划分为3个程度：低于30％为轻度感染，30％-60％为中度感染，高于60％为重度感染。

1.2.2人附红细胞体分离纯化方法

(1)取筛选好人附红细胞体重度感染患者edta抗凝血，2000转/分钟，离心10分钟，弃去上清。

(2)在所剩的红细胞泥中加入等体积阿氏液垂悬红细胞悬液。

(3)然后将其转移置新的大号离心管中，加入等体积的淋巴细胞分离液，2500转/分钟离心20分钟；

(4)弃去白细胞层，将红细胞泥用等体积的阿氏液垂悬，50c水浴30分钟，使附红细胞体与红细胞分离。

(5)2000转/分钟离心30分钟，弃去上清，所得沉淀垂悬于适量的阿氏液中，并用血细胞计数板将浓度调整为1.10⁷个/ul此时用显微镜观察，视野中可见运动中的、大小不一的附红细胞体。

1.2.3瑞氏染液配制方法

(1)把瑞士染粉1.2g，加入研钵，研成粉末。

(2)加入甘油80ml。

(2)加入甲醇600ml，常温下放置3个月。

1.2.4瑞士缓冲液配置方法

(1)取1％磷酸二氢钾30ml，1％磷酸氢二钠20ml，加蒸馏水至1000ml.

(2)调整其ph在6.4-6.8，121℃高压灭菌30min，封口放4℃冰箱备用。

1.2.5阿氏液配制

(1)取葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.80g，加蒸馏水至100ml.

(2)将ph调至6.1，过滤后分装.

(3)121高压灭菌30min，封口放4℃冰箱备用。

1.2.6瑞士染色方法

(1)感染的第1、3、5、7、9、11d上午8:30从大鼠尾静脉采血进行瑞士染色。

(2)血涂片平置于染色架上，根据血膜大小滴加适量瑞氏染液，一般3～5滴，使其迅速盖满血膜。

(3)加染液一倍量的缓冲液，用洗耳球对准血涂片，使染液与缓冲液充分混合，染色10min，以固定血片。

(4)水洗30s，待自然干燥后，经油浸物镜光学显微镜检查计数其感染率并观察红细胞大小、形态、颜色。

1.2.7sd大鼠感染人附红细胞体模型的构建方法

(1)将准备好的人附红细胞体分离纯化液经腹腔注射的方式进行接种。

(2)模型组大鼠每只注射100ul分离纯化液(浓度为1.10⁷个/ul)，对照组大鼠每只腹腔注射100ul无菌生理盐水注射液。

1.2.8体温测量方法

在实验期间的(0、3、5、7、9、11)天，每天上午八点，用电子体温计测量大鼠体温。

1.2.9临床症状观察

在实验期间的(0、3、5、7、9、11)天，每天上午八点在测量相关指标的同时观察大鼠的精神状态、饮食饮水情况、皮肤、巩膜有无黄染、脱毛严重与否。

1.2.10数据处理

用重复测量方差分析方法分析感染率，检验水准采用a＝0.05，实验结果用均数±标准差进行统计描述，图表中^a表示与对照组相比，差异具有统计学意义，p＜0.05；

b、c、d、e分别表示与表示与第1、3、5、7天相比，差异具有统计学意义。

2结果

2.1人附红细胞体重度感染患者血液样本筛选结果见图1。

在300个患者中筛选出18例附红细胞体重度染患者血液样本。

2.2人附红细胞体分离纯化结果见图2

从18例附红细胞体重度感染患者血液也样本中分离出了15ml人附红细胞体分离纯化液原液，计数浓度后调整为34ml浓度为1x10⁷个/ul的人附红细胞体分离纯化液。

2.3人附红细胞体病大鼠感染模型不同时间点瑞士染色结果见图3。

2.3人附红细胞体病sd大鼠感染模型瑞士染色

如图3模型组第0d：红细胞呈淡粉色，边缘整齐，未见附红细胞体寄生，感染率为0；第3d红细胞边缘有少量淡棕褐色、圆形附红细胞体寄生，使部分红细胞边缘突起，平均感染率为18％；第5d，红细胞淡染区扩大，红细胞均有轻度变形，几乎看不到正常红细胞，红细胞表面附红细胞体明显增加，血浆中也开始见到附红体，感染率为平均37.6％。第7天红细胞色淡、变大，严重变形红细胞增多，红细胞膜失去完整性，血浆中可见到的活动的附红体明显增多，感染率为平均68.6％。第9d红细胞表面及血浆中仍有大量附红体活动，但未见继续增加，感染率为平均65.9％。第11d感染率为平均63.0％，较第9天比较未见明显变化。如图4对照组血涂片红细胞呈淡粉色、形态完整、未见明显变化.

2.4如图5所示：

模型组大鼠感染率随着感染时间的增加而增加，其中第七天感染率最高对照组未见明显变化。

表1感染率(n＝9，％)

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。