本发明属于兽用生物制品
技术领域：
，具体涉及一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法。
背景技术：
：体外细胞培养生产病毒是国内外最常用的手段，其中，传统的转瓶细胞培养工艺存在细胞密度低、病毒产率低、生产成本高、劳动强度大等缺点，逐渐为新兴的细胞悬浮培养技术所取代。细胞悬浮培养技术以其自动化、规模化、细胞培养简易化、操作安全化、批间均一化等优势弥补了传统转瓶培养技术的众多不足，解决实际生产过程中的人工、成本、场地、生产周期、原材料控制、质量不稳定等诸多问题。悬浮培养技术是在生物反应器中、人工条件下高密度大规模培养动物细胞用于生物制品生产的技术，根据细胞是否贴壁，分为全悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体悬浮培养。细胞微载体悬浮培养即细胞贴附在微载体上，再借助搅拌系统悬浮在培养液中培养。载体培养本质上还是贴壁培养，技术难度低，适用于难以驯化为全悬浮的细胞，而且载体培养在成本、细胞密度、操作简便性和工业放大等方面有重大的先天缺陷，其最大培养体积不超过300升，这限制了该技术的大规模化应用。全悬浮细胞培养不需要借助微载体，可在连续密闭的系统中进行，减少了操作步骤和污染的机会，实现线性化放大生产，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量，因此，利用全悬浮细胞培养技术生产病毒疫苗具有重大的应用前景。如公开号为：cn104027798a的中国专利申请“一种全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型抗原的方法”以pk-15b1细胞全悬浮无血清培养生产pcv2抗原，可获得高产量和质量的猪圆环病毒2型抗原。猪伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus，prv)属于疱疹病毒科中疱疹病毒亚科猪疱疹病毒ⅰ型，能引起急性传染的猪伪狂犬病(aujeszky′sdisease)。猪伪狂犬病在世界范围内大流行，对全球的养猪业危害极大，造成巨大的经济损失。猪发生伪狂犬病以后，其临床症状取决于感染猪的年龄、病毒株的毒力、感染的剂量和途径。成年猪一般呈隐性感染，怀孕母猪可导致流产、死胎、木乃伊和种猪不育等综合症候群。15日龄以内的仔猪发病死亡率可达100％，断奶仔猪发病率40％，死亡率20％左右；对成年肥猪可引起生长停滞，增重缓慢等。目前本病被认为是威胁养猪生产和引起死亡的主要疾病之一。目前，国内体外细胞生产猪伪狂犬病毒抗原主要采用转瓶培养方法，少数采用微载体悬浮培养方法。其中，转瓶工艺生产半成品抗原效价较低，仅为105.0-6.8tcid50/ml，需要进行高倍浓缩，且生产周期长，需要10天。而微载体悬浮培养工艺，较转瓶工艺虽有提高，仍存在较大改进空间，其生产周期仍需6～7天，且成本较高，难以实现扩大培养。目前，没有利用全悬浮细胞培养技术生产猪伪狂犬病毒抗原的相关报道。技术实现要素：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法。本发明提供的技术方案为如下：本发明提供一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，其包括以下步骤：(1)将种子细胞bhk21进行复苏，用摇瓶悬浮培养扩增，然后接种至搅拌式生物反应器中采用低血清培养基进行悬浮培养，得到悬浮培养细胞液；(2)将生物反应器中悬浮细胞停止搅拌并低温沉降18～24h，然后抽出上清中的低血清培养基并输入无血清培养基，继续培养1～2d，然后将prv种毒液接种入反应器中，进行病毒培养；(3)在生物反应器中继续培养bhk21悬浮细胞96～144h，直至死细胞数量达到90％以上，收获细胞悬液，冻融3次，4000rpm离心5min，收集上清，即得病毒液；(4)将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，即得。进一步地，上述步骤(1)将种子细胞bhk21进行复苏，用摇瓶悬浮培养扩增具体为：将bhk21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的dmem培养基中，在37℃，5％co2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％edta胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的dmem培养基调整细胞密度为3～5×105个/ml的细胞悬液，接种于摇瓶中，加入含2～4％新生牛血清的营养液进行悬浮培养，直至细胞密度达到2～4×106个/ml。进一步地，所述摇瓶悬浮培养的条件为：将摇瓶置于37℃，5％co2培养箱中进行培养，转速设置为130～150rpm/min；进一步地，所述含2～4％新生牛血清的营养液为含有0.4～1.2mg/l二亚油酰磷脂胆碱、20～40g/lnbcs、6～12mg/l软磷脂、4～6％(m/v)生长促进剂的dmem/f12(1:1)培养液。进一步地，所述步骤(1)接种至搅拌式生物反应器中采用低血清培养基进行悬浮培养具体为：待摇瓶中的细胞长至2～4×106个/ml，停止摇瓶，2000rpm离心5min，弃掉上清，加入低血清培养基调整细胞密度至3～5×105个/ml，然后接种于搅拌式生物反应器中，在低血清培养基条件下，于在37℃，5％co2，ph7.0～7.4，溶氧do30～60％，搅拌速度100～120r/min继续进行悬浮培养。进一步地，所述低血清培养基为含有0.2～0.6％(m/v)植物蛋白肽、0.5～1.0％(m/v)fbs、0.1～0.5％(m/v)大豆异黄酮、1.0～1.2％(v/v)双抗、1～3％(m/v)生长促进剂的dmem/f12(1:1)培养液。优选地，所述低血清培养基还含有2～4％(m/v)聚谷氨酸。进一步地，所述步骤(2)具体为：待反应器中的细胞长至2～4×106个/ml，将反应器中悬浮细胞停止搅拌并在4～6℃下沉降18～24h，然后抽出上清中的低血清培养基并输入无血清培养基，继续培养1～2d，然后按细胞悬液体积1％的比例接种prv种毒液，进行病毒培养，所述种毒液中病毒含量为105.2tcid50/ml。进一步地，所述无血清培养基为含有0.6～1.2％(m/v)植物蛋白肽、0.2～0.6％(m/v)大豆异黄酮、1.5～3.5％(m/v)聚谷氨酸、1.0～1.2％(v/v)双抗、4～6％(m/v)生长促进剂的dmem/f12(1:1)培养液。本发明所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.05～0.2的质量比组成，优选地，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。进一步地，所述步骤(4)浓缩具体为：将病毒液通过50k中空纤维柱进行浓缩；灭活具体为：采用福尔马林灭活，所述福尔马林在病毒浓缩液的终浓度为0.1％；除菌具体为：将灭活后的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。进一步地，上述的双抗为含100iu/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素溶液。进一步地，上述采取全悬浮细胞培养制得的猪伪狂犬病毒抗原可添加一定量的佐剂乳化制成成品疫苗。本发明人在试验中发现，将使用含10％新生牛血清的dmem培养基培养的bhk21细胞扩增到细胞密度达到2～4×106个/ml，直接加入低血清培养基进行悬浮培养，bhk21细胞的生长速度缓慢，细胞活性下降，低血清培养基不能支撑悬浮bhk21细胞持续稳定的生长。本发明人通过大量的试验意外发现，在使用含10％新生牛血清的dmem培养基对bhk21细胞进行培养后，加入含2～4％新生牛血清的营养液进行过渡培养，可显著改善bhk21细胞在低血清培养基的生长状态，尤其当所述的营养液中含有一定量的生长促进剂，改善的效果更佳，取得了意料不到的技术效果。在本发明用bhk21细胞全悬浮培养生产猪伪狂犬病毒抗原的过程中，使用的低血清培养基和无血清培养基均添加由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以一定质量比组成的生长促进剂，所述的生长促进剂能使bhk21细胞在低血清甚至无血清的环境下保持较佳的生长状态，促进病毒在细胞中的繁殖，大大提高了生产效率。所述的活性矿物酵母多肽(acbbio-chelate5)是矿物元素与酵母多肽形成的络合物，具体为酵母多肽络合的锌、铜、镁、铁和硅，购自美国艾缇科技公司(activeconcepts)，为bhk21细胞和病毒的生长繁殖提供了必不可少的营养元素，促进细胞和病毒的繁殖。所述的硫酸角质素寡聚糖以低聚糖的形式存在，有利于细胞吸收，其具有一些生长因子的类似作用，可刺激细胞繁殖与分化，提高bhk21细胞全悬浮培养密度。具体地，所述的硫酸角质素寡聚糖为硫酸角质素低聚糖混合物，即为硫酸角质素二糖、硫酸角质素三糖、硫酸角质素四糖、硫酸角质素五糖的混合物，其制备方法参考公开号为cn1174557a的中国专利“硫酸角质素寡聚糖级分及含该级分的药剂”，具体为：取硫酸角质素50g，溶解在300ml的0.1m醋酸缓冲液(ph6.0)中，加入25u内-β-n-乙酰基葡萄糖胺酶型硫酸降解酶，在37℃下降解24h。反应结束后，加入2倍体积的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，在4000rpm下离心15min，取上清(上清a)。往沉淀中加入300ml蒸馏水，进行溶解，加入3倍量的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，4000rpm下离心15min，取上清(上清b)。将上清a和上清b混合，减压浓缩，使用bio-gel-p-2柱(3.6╳134cm)，以蒸馏水作为溶剂，进行凝胶过滤，将滤液冷冻干燥即得。优选地，本发明人根据上述公开的方法进行改进，以调整硫酸角质素寡聚糖中硫酸角质素二糖、硫酸角质素三糖、硫酸角质素四糖、硫酸角质素五糖的比例。经试验，本发明人发现硫酸角质素寡聚糖中硫酸角质素二糖的含量越高，更有利于bhk21细胞在低血清甚至无血清培养基中生长，促进病毒繁殖。聚谷氨酸为发酵黄豆富含的一种物质，本发明人通过大量实验发现，在低血清培养基和无血清培养基中添加一定量的聚谷氨酸，可有效改善bhk21细胞悬浮生长的状态，提高细胞活力，减少死细胞的出现，促进细胞生长，使bhk21细胞在低血清培养基和无血清培养基中悬浮培养的细胞密度达到2～4×106个/ml，甚至可超过这水平，为生产高浓度的猪伪狂犬病毒抗原疫苗奠定了技术基础。与现有技术相比，本发明的优势在于：(1)本发明采用全悬浮细胞培养生产的猪伪狂犬病毒抗原，与传统的转瓶细胞培养工艺和微载体悬浮培养工艺比较，大大提高了生产效率，并易于进行扩大培养，降低生产成本，改善产品质量，提升疫苗的安全性。(2)本发明采用无血清培养基进行细胞悬浮培养，能较好地支持bhk21细胞的正常生长，使其在反应器中悬浮培养能较快达到较高的细胞密度，且保持良好的生长活性，为生产高浓度的猪伪狂犬病毒抗原疫苗奠定了技术基础，所得的猪伪狂犬病毒抗原疫苗效价高，稳定在108.5tcid50/ml以上，且纯度高，质量稳定，显著改善产品品质。具体实施方式以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。实施例1硫酸角质素寡聚糖制备及成分分析a组的制备：取硫酸角质素50g，溶解在300ml的0.1m醋酸缓冲液(ph6.0)中，加入25u混合酶，在37℃下降解24h。反应结束后，加入2倍体积的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，在4000rpm下离心15min，取上清(上清a)。往沉淀中加入300ml蒸馏水，进行溶解，加入3倍量的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，4000rpm下离心15min，取上清(上清b)。将上清a和上清b混合，减压浓缩，使用bio-gel-p-2柱(3.6╳134cm)，以蒸馏水作为溶剂，进行凝胶过滤，将滤液冷冻干燥即得。b-d组硫酸角质素寡聚糖的制备参考a组。硫酸角质素寡聚糖的成分分析将上述a-d组制得的硫酸角质素寡聚糖分别采用离子交换色谱进行分离，分别取得硫酸角质素二糖、硫酸角质素三糖、硫酸角质素四糖、硫酸角质素五糖级分，经冷冻干燥后，采用高效液相色谱进行分析，检测各成分的含量，结果见下表所示：表150g硫酸角质素制得的寡聚糖中各低聚糖的含量组成(含量％)硫酸角质素二糖硫酸角质素三糖硫酸角质素四糖硫酸角质素五糖a20.812.66.22.5b23.613.24.72.2c22.712.85.52.0d20.212.45.72.8实施例2硫酸角质素寡聚糖对bhk-21细胞生长的影响分别采用实施例1a-d组制得硫酸角质素寡聚糖对bhk21细胞进行培养，具体为：将bhk21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的dmem培养基中，在37℃，5％co2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％edta胰蛋白酶消化液，37℃消化6min，使用含10％新生牛血清的dmem培养基调整细胞密度为5×105个/ml的细胞悬液，接种于摇瓶中，加入含2％新生牛血清的营养液在37℃，5％co2培养箱中进行培养，转速设置为150rpm/min条件下进行悬浮培养，直至细胞密度达到4×106个/ml，其中，含2％新生牛血清的营养液为含有1.0mg/l二亚油酰磷脂胆碱、20g/lnbcs、10mg/l软磷脂、6％(m/v)生长促进剂的dmem/f12(1:1)培养液，所述的生长促进剂为实施例1a(b或c或d)组制得的硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成，培养48h后，统计细胞的生长密度，结果见下表2。表2不同组别的硫酸角质素寡聚糖对bhk-21细胞生长的影响组别培养48h后细胞密度(个/ml)a组1.95×106b组2.20×106c组2.14×106d组1.90×106由上表2可知，硫酸角质素寡聚糖中硫酸角质素二糖的含量越高，更有利于bhk21细胞在2％新生牛血清的营养液中生长，使细胞在转瓶中培养48h后的密度达到2.20×106个/ml。实施例3全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原(1)将种子细胞bhk21进行复苏，用摇瓶悬浮培养扩增：将bhk21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的dmem培养基中，在37℃，5％co2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％edta胰蛋白酶消化液，37℃消化6min，使用含10％新生牛血清的dmem培养基调整细胞密度为5×105个/ml的细胞悬液，接种于摇瓶中，加入含3％新生牛血清的营养液在37℃，5％co2培养箱中进行培养，转速设置为150rpm/min条件下进行悬浮培养，直至细胞密度达到4×106个/ml，其中，含3％新生牛血清的营养液为含有1.0mg/l二亚油酰磷脂胆碱、30g/lnbcs、10mg/l软磷脂、6％(m/v)生长促进剂的dmem/f12(1:1)培养液，所述的生长促进剂由实施例1b组制得的硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。(2)将摇瓶悬浮培养的bhk21细胞接种至搅拌式生物反应器中采用低血清培养基进行悬浮培养：待摇瓶中的细胞长至4×106个/ml，停止摇瓶，2000rpm离心5min，弃掉上清，加入低血清培养基调整细胞密度至5×105个/ml，然后接种于搅拌式生物反应器中，在低血清培养基条件下，于在37℃，5％co2，ph7.2，溶氧do50％，搅拌速度100r/min继续进行悬浮培养，其中，低血清培养基为含有0.4％(m/v)植物蛋白肽、1.0％(m/v)fbs、0.4％(m/v)大豆异黄酮、1.0％(v/v)双抗、2％(m/v)生长促进剂、4％(m/v)聚谷氨酸的dmem/f12(1:1)培养液，所述的生长促进剂由实施例1b组制得的硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。(3)待反应器中的细胞长至4×106个/ml，将反应器中悬浮细胞停止搅拌并在4℃下沉降24h，然后抽出上清中的低血清培养基并输入无血清培养基，继续培养2d，然后按细胞悬液体积1％的比例接种prv种毒液，进行病毒培养，所述种毒液中病毒含量为105.2tcid50/ml，其中，无血清培养基的组成为含有0.8％(m/v)植物蛋白肽、0.4％(m/v)大豆异黄酮、2.0％(m/v)聚谷氨酸、1.0％(v/v)双抗、6％(m/v)生长促进剂的dmem/f12(1:1)培养液，所述的生长促进剂由实施例1b组制得的硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。(4)在生物反应器中继续培养bhk21悬浮细胞120h，直至死细胞数量达到90％以上，收获细胞悬液，冻融3次，4000rpm离心5min，收集上清，即得病毒液；(5)将收获的病毒液通过50k中空纤维柱进行浓缩，然后加入福尔马林灭进行灭活，其中，福尔马林在病毒浓缩液的终浓度为0.1％(v/v)，最后将灭活后的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。实施例4全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原(1)将种子细胞bhk21进行复苏，用摇瓶悬浮培养扩增：将bhk21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的dmem培养基中，在37℃，5％co2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％edta胰蛋白酶消化液，37℃消化8min，使用含10％新生牛血清的dmem培养基调整细胞密度为3×105个/ml的细胞悬液，接种于摇瓶中，加入含2％新生牛血清的营养液在37℃，5％co2培养箱中进行培养，转速设置为140rpm/min条件下进行悬浮培养，直至细胞密度达到3×106个/ml，其中，含2％新生牛血清的营养液为包含有0.6mg/l二亚油酰磷脂胆碱、20g/lnbcs、10mg/l软磷脂、4％(m/v)生长促进剂的dmem/f12(1:1)培养液，所述的生长促进剂由实施例1b组制得的硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.2的质量比组成。(2)将摇瓶悬浮培养的bhk21细胞接种至搅拌式生物反应器中采用低血清培养基进行悬浮培养：待摇瓶中的细胞长至3×106个/ml，停止摇瓶，2000rpm离心5min，弃掉上清，加入低血清培养基调整细胞密度至3×105个/ml，然后接种于搅拌式生物反应器中，在低血清培养基条件下，于在37℃，5％co2，ph7.4，溶氧do60％，搅拌速度120r/min继续进行悬浮培养，其中，低血清培养基的组成为包含有0.6％(m/v)植物蛋白肽、0.5％(m/v)fbs、0.2％(m/v)大豆异黄酮、1.2％(v/v)双抗、2％(m/v)生长促进剂、4％(m/v)聚谷氨酸的dmem/f12(1:1)培养液，所述的生长促进剂由实施例1b组制得的硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.2的质量比组成。(3)待反应器中的细胞长至3×106个/ml，将反应器中悬浮细胞停止搅拌并在6℃下沉降24h，然后抽出上清中的低血清培养基并输入无血清培养基，继续培养2d，然后按细胞悬液体积1％的比例接种prv种毒液，进行病毒培养，所述种毒液中病毒含量为105.2tcid50/ml，其中，无血清培养基的组成为包含有1.2％(m/v)植物蛋白肽、0.5％(m/v)大豆异黄酮、3.5％(m/v)聚谷氨酸、1.0％(v/v)双抗、4％(m/v)生长促进剂的dmem/f12(1:1)培养液，所述的生长促进剂由实施例1b组制得的硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.2的质量比组成。(4)在生物反应器中继续培养bhk21悬浮细胞144h，直至死细胞数量达到90％以上，收获细胞悬液，冻融3次，4000rpm离心5min，收集上清，即得病毒液；(5)将收获的病毒液通过50k中空纤维柱进行浓缩，然后加入福尔马林灭进行灭活，其中，福尔马林在病毒浓缩液的终浓度为0.1％(v/v)，最后将灭活后的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。实施例5猪伪狂犬病毒抗原成品疫苗制备(1)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-804份，先将白油缓慢加温，加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；(2)水相制备：取实施例3制得的疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-804份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；(3)乳化：将水相加入到油相中，利用ika乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；(4)分装：将制备的疫苗按照每瓶250ml进行分装。对比例1全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原对比例1全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的步骤与实施例3基本相同，区别在于，所述步骤(1)中不使用含3％新生牛血清的营养液，而是使用含10％新生牛血清的dmem培养基对bhk21细胞进行摇瓶培养，具体为：将种子细胞bhk21进行复苏，用摇瓶悬浮培养扩增：将bhk21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的dmem培养基中，在37℃，5％co2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％edta胰蛋白酶消化液，37℃消化8min，使用含10％新生牛血清的dmem培养基调整细胞密度为5×105个/ml的细胞悬液，接种于摇瓶中，加入含10％新生牛血清的dmem培养基，在37℃，5％co2培养箱中进行培养，转速设置为140rpm/min条件下进行悬浮培养，直至细胞密度达到4×106个/ml。其他步骤与实施例3相同。对比例2全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原对比例2全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的步骤与实施例3基本相同，区别在于，所述步骤(2)低血清培养基和步骤(3)无血清培养基均不含生长促进剂。对比例3全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原对比例3全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的步骤与实施例3基本相同，区别在于，所述步骤(2)低血清培养基和步骤(3)无血清培养基中的生长促进剂仅含硫酸角质素寡聚糖。对比例4全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原对比例4全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的步骤与实施例3基本相同，区别在于，所述步骤(2)低血清培养基和步骤(3)无血清培养基中的生长促进剂仅活性矿物酵母多肽。对比例5全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原对比例5全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的步骤与实施例3基本相同，区别在于，所述步骤(2)低血清培养基和步骤(3)无血清培养基中的生长促进剂由硫酸角质素和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。对比例6全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原对比例6全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的步骤与实施例3基本相同，区别在于，所述步骤(2)和步骤(3)中的低血清培养基和无血清培养基均不添加聚谷氨酸。对比例7全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原对比例7全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的步骤与实施例3基本相同，区别在于，所述步骤(2)和步骤(3)中的低血清培养基和无血清培养基均为市售产品，均购自德国的probiogen公司。试验例一、病毒滴度检测按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》对实施例3-4和对比例1-7全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒滴度进行检测，结果见下表3。表3病毒滴度检测结果组别病毒含量(tcid50/ml)实施例3108.9实施例4108.7对比例1105.5对比例2105.7对比例3106.4对比例4106.9对比例5107.0对比例6106.2对比例7105.9由上表可知，本发明实施例3-4全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒滴度较高，均＞108.5tcid50/ml，明显优于对比例1-7全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒滴度。由对比例1可知，使用含10％新生牛血清的dmem培养基对bhk21细胞进行培养后，继续使用含10％新生牛血清的dmem培养基对bhk21细胞进行培养摇瓶悬浮培养，并不能有效改善bhk21细胞的生长状态，将摇瓶悬浮培养的bhk21转移至低血清培养环境进行反应器悬浮培养，细胞的生长速度缓慢，细胞活性下降，低血清培养基不能支撑悬浮bhk21细胞持续稳定的生长。而加入含2～4％新生牛血清的营养液进行过渡培养，可显著改善bhk21细胞在低血清培养基的生长状态，从而进一步提高培养病毒滴度。由对比例2-5和6可知，在低血清培养基和无血清培养基中分别添加一定量由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽组成的生长促进剂、聚谷氨酸，可有效改善bhk21细胞悬浮生长的状态，提高细胞活力，减少死细胞的出现，促进细胞生长，从而进一步提高培养病毒滴度。试验例二、抗原疫苗质量控制根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》对本发明实施例3-4和对比例1-7制得的猪伪狂犬病毒抗原疫苗进行无菌检验、支原体检验、外源性病毒检测，结果均未检出。试验例三、安全性评价分别对本发明实施例3-4和对比例1-7制得的猪伪狂犬病毒抗原成品疫苗进行安全性评价，具体为：选取135头14～21日龄仔猪，分为9组，每组15头，分别注射实施例3-4和对比例1-7制得的猪伪狂犬病毒抗原成品疫苗，注射剂量为4ml/头，观察仔猪的局部和全身不良反应，结果见下表4。表4安全性评价结果以上结果表明,使用本发明实施例3-4和对比例1-6制得的猪伪狂犬病毒抗原成品疫苗免疫仔猪，所有免疫仔猪的精神状态、采食量及体温均未出现异常，也无全身反应，而采用市售培养基生产的疫苗有3头出现局部的红、肿、硬结现象，有2头出现短暂的温度升高(对比例7)。提示本发明纯化抗原制备疫苗的安全性好。试验例四、抗体诱导试验分别采用本发明实施例3和对比例1-7制得的猪伪狂犬病毒抗原成品疫苗免疫小鼠21d，检测小鼠血清中的抗体水平，并与免疫前小鼠血清中的抗体水平进行比较，观察病毒抗原诱导体内产生抗体的水平，结果见下表5。表5免疫21d后小鼠血清抗体检测结果(elisaod450值)注：判定标准，elisaod450＞0.6，则为阳性，elisaod450＜0.4，则为阴性。结果显示，本发明实施例3制得的猪伪狂犬病毒抗原疫苗可显著提高小鼠体内的抗体水平，促进小鼠体内产生相应的抗体，效果优于对比例1-7，说明本发明提供的抗原疫苗能引起较好的免疫反应。试验例五、攻毒保护评价分别采用本发明实施例3和对比例1-7制得的猪伪狂犬病毒抗原成品疫苗免疫小鼠21d，每只小鼠攻毒剂量为0.45ml/只，21d天后采集小鼠脾脏、分离病毒，采用间接免疫荧光(ifa)进行检测，观察病毒对小鼠脾脏攻毒的情况和保护率，结果见下表6。表6小鼠脾毒保护效果组别小鼠总数(只)ifa阳性(只)ifa阴性(只)阳性率(％)保护率(％)实施例3150150100对比例1158753.346.7对比例2157846.753.3对比例315694060对比例41551033.366.7对比例51541126.773.3对比例615694060对比例7157846.753.3对小鼠进行攻毒保护试验的结果显示本发明实施例3制得的猪伪狂犬病毒抗原疫苗的免疫保护率达到100％，完全达到疫苗效力评价标准。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12