本发明属于分离分析技术领域，具体涉及一种环烯醚萜苷假模板分子印迹聚合物及其制备方法与应用。
技术背景
现代化的中药质量评价模式是确保中药质量及其疗效的关键所在。由于中药多组分、多靶点的特点，单一指标性成分测定已不能适应建立现代化中药质量评价模式的要求。以中国药典为例，2010版药典选用丹参酮ⅱa、盐酸小檗碱、马钱苷作为丹参、功劳木、山茱萸及其复方制剂(如六味地黄丸、杞菊地黄丸、知柏地黄丸和桂附地黄丸等)的指标成分，而2015版中国药典则变更增选丹参酮ⅱa、隐丹参酮与丹参酮ⅰ总量作为丹参质量控制标准，增选非洲防己碱、药根碱、巴马汀和小檗碱总量作为功劳木指标成分，增选马钱苷、莫诺苷作为山茱萸及其方剂质量控制标准。药效组分群质量评价模式替代单组分质量评价模式已成为中药质量评价方法的发展趋势。
环烯醚萜苷类“药效组分群”广泛共存于玄参科、茜草科、唇形科、龙胆科、马鞭草科等双子叶植物中，具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗氧化、抗病毒、降血糖、治疗白血病、防治心脑血管疾病等多种生物活性，常作为栀子、龙胆、山茱萸等药材及其复方制剂的质量控制指示性成分。环烯醚萜苷化学结构相近且基体复杂，如山茱萸复方制剂六味地黄丸中环烯醚萜苷类成分包括马钱苷、莫诺苷、甲氧基莫诺苷、断氧化马钱苷、獐牙菜苷、山茱萸苷等。六味地黄丸由熟地黄、山茱英制、牡丹皮、山药、获答、泽泻等六味中药组合而成的，作为滋阴补肾的中药，临床效果甚佳。2015版中国药典中选马钱苷和莫诺苷总量作为六味地黄丸质量控制标准，并且在成方制剂和单味制剂中的六味地黄丸，要求每丸含酒萸肉以莫诺苷(c17h26o11)和马钱苷(c17h26o10)的总量计，不得少于0.37mg。粗提液及混合对照品hplc色谱图所示，中药或方剂中相近保留时间化学成分的“峰重叠”制约了样品中的色谱峰识别。复杂基质下药效组分群的快速靶向富集已成为中药质量评价的关键问题之一。加强高极性药效组分群分离基础研究，利于突破中药复杂样品物质分离瓶颈，为中药质量评价模式的制定提供理论依据。
分子印迹技术能够制备“预构化”的分子印迹聚合物(mips)，mips对于目标分子具有特异识别性。因mips材料极高的选择性及卓越的分子识别性能，很快在固相萃取、手性拆分、生物传感器等方面得到了广泛的应用。分子印迹-固相萃取技术将mips用作固相萃取填料从样品中纯化、富集目标分子及其结构类似物，能够克服分析过程中因基质复杂所带来的内源性干扰难题，在中药及其制剂质量控制方向展现出极大应用前景。分子印迹对于在天然产物中含量低、药效高的成分的鉴定分析和分离纯化提供了方法借鉴，但是其特异选择性有待提高。
目前环烯醚萜苷分子印迹聚合物分别由专利201510861116.9、201610542765.7和201611121434.2制得。传统环烯醚萜苷分子印迹聚合物均以京尼平苷等环烯醚萜苷为模板制备。该方法面临着一些技术上的挑战。首先，模板泄漏(templatebleeding)问题便是其中之一。由于在传统的mip合成中使用大量目标分子作为模板分子，mip的网络交联度很高，模板分子完全去除比较困难，即使经过有机溶剂的反复洗脱，仍然会存在模板残留的问题。这样的mip作为填充材料应用于微痕量物质的分析检测与提取时，模板分子会缓慢地释放到样品中，从而引起样品污染，并降低分析的精确度和准确度。其次，模板分子环烯醚萜苷价格昂贵，制约了环烯醚萜苷分子印迹聚合物的大规模制备。
技术实现要素：
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种环烯醚萜苷假模版分子印迹聚合物的制备方法，以环烯醚萜苷类似物4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷为假模板，将假模板、功能单体、交联剂、引发剂、制孔剂按照本体聚合的方法制得分子印迹聚合物。
本发明的第二个目的在于提供上述制备方法制备得到的假模板分子印迹聚合物。
本发明的第三个目的在于提供该假模版分子印迹聚合物在六味地黄丸中环烯醚萜苷的提取分离中的应用。
为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种环烯醚萜苷假模版分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
1)以环烯醚萜苷类似物4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷为假模板，将假模板、功能单体、交联剂、引发剂和制孔剂加入反应釜中混合，超声脱气和充氮除氧后，恒温聚合，得到带有假模板分子的聚合物；
2)将步骤1)中制备的带有假模板分子的聚合物研磨、清洗除去模板分子，得到留有分子印迹孔穴的分子印迹聚合物颗粒。
本发明在分子印迹聚合物合成过程中选用4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷作为模板，利用分子印迹技术为环烯醚萜苷量身定做识别材料，洗脱出模板，在材料上留有与环烯醚萜苷分子体积、结构、极性相匹配的孔穴(或称为印迹)，模板洗脱时，4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷可以被较为完全地洗脱，最大限度降低了模板的残留，避免了对待测样品的污染，可以提高分析的精确度和准确度。同时，与传统模板分子环烯醚萜苷相比，4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷可以采用化学方法合成，而且合成方法简便可行，可以为大规模制备分子印迹聚合物提供可靠的原料来源，使制备成本大大降低。
采用该种方法制备的分子印迹聚合物用于提纯环烯醚萜苷时，只有环烯醚萜苷分子能够进入印迹当中，而其它的杂质分子不能进入印迹，使得该分子印迹聚合物主要吸附环烯醚萜苷，其它的杂质吸附的很少，使得环烯醚萜苷的纯度大大提高，可达到95％以上。
进一步的，步骤1)中，所述功能单体为9-乙烯基蒽或n-乙烯基咔唑。
进一步的，步骤1)中，所述的交联剂为n,n-二甲基二丙烯酰胺、二乙烯基苯。优选为n,n-二甲基二丙烯酰胺。
进一步的，所述制孔剂为二甲基亚砜或四氢呋喃；优选为四氢呋喃。
进一步的，所述引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异戊腈；优选为偶氮二异丁腈。
进一步的，步骤1)中，假模板、功能单体、交联剂、引发剂、制孔剂按质量比为1-3:2-6:15-30:0.05-0.10:20-70。采用该配比合成的分子印迹聚合物用于环烯醚萜苷的分离提取时，具有更好的选择性，有利于提高检测的准确性。
进一步的，步骤1)中，超声脱气的时间为10-15min，充氮除氧的时间为10-15min。
进一步的，步骤1)中，恒温聚合的温度为40-60℃，时间为18-24h。
进一步的，步骤2)中，将聚合物研磨后过150-200目筛，得到均匀的带有模板分子的分子印迹聚合物颗粒。
进一步的，步骤2)中，采用体积分数为10％-20％的乙酸的甲醇溶液洗脱除去分子印迹聚合物中的模板分子。
试验发现，采用体积分数为10％-20％的乙酸的甲醇溶液对带有模板的分子印迹聚合物进行洗涤时，可以彻底除去聚合物中的模板分子，最大限度降低了模板分子的残留量，避免了分子印迹聚合物对待测样品溶液的污染。
进一步的，步骤2)中，还包括对制备得到的分子印迹聚合物颗粒进行烘干的步骤，烘干的温度为50-65℃。该烘干温度下，一方面可以提高烘干的速度，另一方面可以避免过高温度对分子印迹聚合物颗粒产生破坏。
上述制备方法制备得到的环烯醚萜苷假模版分子印迹聚合物。
上述环烯醚萜苷假模版分子印迹聚合物在分离提取中药及其制剂中环烯醚萜苷的应用，尤其在六味地黄丸中环烯醚萜苷的提取分离中的应用。
利用上述环烯醚萜苷假模版分子印迹聚合物分离提取环烯醚萜苷的方法，包括如下步骤：
1)将制备得到的环烯醚萜苷假模版分子印迹聚合物颗粒作为柱层析填料装柱；
2)将中药材或中药制剂的提取液上柱吸附；
3)首先用乙腈/乙醇溶液淋洗，最后用醋酸的水溶液洗脱，回收洗脱液得到提取后的环烯醚萜苷。
进一步的，步骤3)中，乙腈/乙醇溶液中乙腈和乙醇的体积比为8-10:1。
进一步的，步骤3)中，醋酸的水溶液中水和醋酸的体积比为99:1-90:10。
本发明的有益效果为：
1、本发明中将环烯醚萜苷类似物4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷作为分子印迹聚合物制备的模板分子，4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷可以采用简便的化学合成法制备，较传统的“天然环烯醚萜苷模板分子”成本低，来源可靠，而且该种模板可以较为彻底地洗脱，避免了对待测样品溶液的污染。
2、本发明的另一主要创新点为采用的功能单体9-乙烯基蒽、n-乙烯基咔唑，均为首次应用于环烯醚萜苷分子印迹领域。
3、本发明用于提纯环烯醚萜苷的分子印迹聚合物选择性强，应用该材料提纯环烯醚萜苷所获得的环烯醚萜苷纯度高。
4、本发明用于提纯环烯醚萜苷的分子印迹聚合物生产成本低，洗脱液用量少。
5、本发明的用于提纯环烯醚萜苷的分子印迹聚合物在应用于从六味地黄丸提液中提纯环烯醚萜苷后可再生，且其再生方法简单。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷制备方法：
在20ml二氯甲烷中加入5克五乙酰基葡萄糖和0.5ml乙酸酐，搅拌溶解，0℃下缓慢滴加10ml45％溴化氢醋酸溶液。室温下反应1小时，加入300ml二氯甲烷稀释，依次用碳酸氢钠溶液、水洗涤，有机相用mgso4干燥，减压蒸馏除去溶剂，得溴代四乙酰基葡萄糖。
将上一步所得溴代四乙酰基葡萄糖溶于18ml苄醇，加入2ghg(oac)2，95℃下反应2小时，滤除不溶物，粗产物经乙醇重结晶得4-苯基-d-四乙酰基吡喃葡萄糖苷。4-苯基-d-四乙酰基吡喃葡萄糖苷溶于100ml甲醇，加入5克甲醇钠，室温下反应4小时，经酸性离子交换树脂纯化，得3.1克4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷。
实施例1
(1)备料
本实施例各组分按如下用量配比配料：模板分子4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷0.93g，功能单体(9-乙烯基蒽)1.65g，交联剂(n,n-二甲基二丙烯酰胺酯)16.00g，引发剂(偶氮二异丁腈)0.08g，制孔剂(二甲基亚砜)45.00g。
(2)制备带有模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(1)中备好的模板分子、9-乙烯基蒽、n,n-二甲基二丙烯酰胺酯、偶氮二异丁腈、二甲基亚砜的混合溶剂加入反应釜中混合均匀，超声脱气15min，然后充氮除氧15分钟，密封后于60℃恒温水浴聚合24小时，得到带有模板分子的分子印迹聚合物，然后将其碾磨过200目筛，即得到带有模板分子环烯醚萜苷的分子印迹聚合物颗粒。
(3)提纯脱去模板分子的分子印迹聚合物
用乙酸体积分数为10％的乙酸甲醇溶液洗脱由步骤(2)所制得的带有模板分子的分子印迹聚合物颗粒，于60℃真空干燥后，即得到所述的用于富集检测六味地黄丸中环烯醚萜苷的分子印迹聚合物17.4g。
(4)取1.6克步骤(3)所制得的用于富集环烯醚萜苷的分子印迹聚合物装柱。称取10g六味地黄丸粉碎，加入50ml乙醇加热回流提取2h后，过滤，滤液上柱。待上柱溶液流尽后，用乙腈/乙醇(9：1，v/v)进行淋洗，层析柱用1ml水/乙酸＝99:1(体积比)洗脱，收集洗脱液，hplc检测，含量如下：
马钱苷10mgg-1、莫诺苷12mgg-1、甲氧基莫诺苷4mgg-1、断氧化马钱苷3mgg-1、獐牙菜苷1mgg-1、山茱萸苷1mgg-1。
(5)分子印迹聚合物的再生
将上述洗去环烯醚萜苷的分子印迹聚合物，用95％乙醇洗脱，即可再生用于下一次提取用。
实施例2
(1)备料
本实施例各组分按如下用量配比配料：模板分子4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷1.51g，功能单体(n-乙烯基咔唑)3.32g，交联剂(n,n-二甲基二丙烯酰胺酯)15.32g，引发剂(偶氮二异戊腈)0.07g，制孔剂(四氢呋喃)40.03g。
(2)制备带有模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(1)中备好的模板分子、n-乙烯基咔唑、n,n-二甲基二丙烯酰胺酯、偶氮二异戊腈、四氢呋喃的混合溶剂加入反应釜中混合均匀，超声脱气13min，然后充氮除氧13分钟，密封后于50℃恒温水浴聚合20小时，得到带有模板分子的分子印迹聚合物，然后将其碾磨过200目筛，即得到带有模板分子环烯醚萜苷的分子印迹聚合物颗粒。
(3)提纯脱去模板分子的分子印迹聚合物
用乙酸体积分数为15％的乙酸甲醇溶液洗脱由步骤(2)所制得的带有模板分子的分子印迹聚合物颗粒，于60℃真空干燥后，即得到所述的用于富集检测六味地黄丸中环烯醚萜苷的分子印迹聚合物。
实施例3
(1)备料
本实施例各组分按如下用量配比配料：模板分子4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷2.51g，功能单体(9-乙烯基蒽)4.32g，交联剂(二乙烯基苯)20.12g，引发剂(偶氮二异戊腈)0.06g，制孔剂(四氢呋喃)50.03g。
(2)制备带有模板分子的分子印迹聚合物
将步骤(1)中备好的模板分子、9-乙烯基蒽、二乙烯基苯、偶氮二异戊腈、四氢呋喃的混合溶剂加入反应釜中混合均匀，超声脱气13min，然后充氮除氧13分钟，密封后于40℃恒温水浴聚合19小时，得到带有模板分子的分子印迹聚合物，然后将其碾磨过170目筛，即得到带有模板分子环烯醚萜苷的分子印迹聚合物颗粒。
(3)提纯脱去模板分子的分子印迹聚合物
用乙酸体积分数为20％的乙酸甲醇溶液洗脱由步骤(2)所制得的带有模板分子的分子印迹聚合物颗粒，于60℃真空干燥后，即得到所述的用于富集检测六味地黄丸中环烯醚萜苷的分子印迹聚合物。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。