一株产磷脂酶D的基因工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于生物技术和磷酯类产品制备领域，具体涉及一种产磷脂酶d的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

磷脂酶d(phospholipased,pld)作为磷酸二酯酶超家族中的一员，是催化磷脂水解第一步反应的关键酶之一，它是一类重要的跨膜信号转导酶类，属于胞外酶，分别由一个基因家族的不同成员编码，广泛存在于微生物，植物和动物中。不仅可以水解磷脂酰胆碱生成胆碱和磷脂酸，也可以催化转磷脂反应，将脂链上伯醇的羟基转移到磷脂酸产物的磷脂酰部分。pld的磷酰基转移作用尤为重要,它可以将大量磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，pc)催化合成为自然界稀有的磷脂质，如磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，pe)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ps)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，pg)。合成的磷脂质在食品、化妆品、药品中有重要作用。

1947年hanahan和chaikoff首次在胡萝卜和白菜叶子中发现了pld，随后人们相继从各种植物的根、叶子和种子等器官中发现并提取了pld。saito和kanfer在研究的鼠脑组织中发现了pld的活性。后来大量研究表明动物体内的pld主要分布在脑、肝脏等组织中，分为膜结合pld和泡液pld两类，但大多数是膜结合pld，难以进行大规模工业化生产。相对于动植物来源的pld，微生物来源的pld具有更强的转磷脂能力和更广泛的底物专一性。从20世纪70年代起，国内外学者开始研究微生物来源的pld，至今已报道的产pld的微生物种类主要有链霉菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌等，其中以来源于链霉菌属的pld转脂活性最高。

pld的制备主要集中在微生物来源的pld。固态发酵制备pld具有单位基质酶活性高、发酵周期短、生产成本低等优点。张梁等发明了一种利用肉桂链轮丝菌as4.1084固态发酵生产pld的方法，通过基因的原核或真核高效表达及定点突变技术，酶的产量及活性可以得到大幅提高。李斌等利用表达载体pet-22b，实现了大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成酶基因在大肠杆菌bl21(de3)中的同源高效表达，并利用镍亲和柱对表达产物进行纯化，目的蛋白表达量是原始菌株的100多倍，同时转化率达到33％，重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力达到69u/mg。liu等将来源于色褐链霉菌的pld在毕赤酵母上通过表面展示，大量合成了磷脂酰丝氨酸，转化率达到67.5％。卢欣睿等通过定点突变pld，139位的苯丙氨酸突变为亮氨酸或甲硫氨酸，272位的脯氨酸突变为丙氨酸，磷脂酰丝氨酸的转化率提高了17％～30％。在工业应用中，美国cargill公司已用pld催化转磷酰基反应制备磷脂酰丝氨酸，并用真空蒸发脱溶剂和干燥产品；国外一些酶制剂公司也生产出具有较高酶活力的pld。而我国对pld的研究尚不成熟，目前还未有相关的pld产品。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种编码磷脂酶d的基因序列。

本发明还要解决的技术问题是提供一种产磷脂酶d的基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述产磷脂酶d的基因工程菌的构建方法。

本发明还要解决的技术问题是提供利用上述基因工程菌发酵产磷脂酶d的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述产磷脂酶d的基因工程菌在制备磷脂酰丝氨酸中的应用。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种编码磷脂酶d的基因序列，其核苷酸序列如seqidno：1所示。该基因来源于streptomycessp.(strainpmf)，其原始基因序列如seqidno：2所示，经密码子优化后该序列可以在大肠杆菌中正常表达。

包含seqidno.1所示核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在本发明的保护范围之内。

一种产磷脂酶d的基因工程菌，该菌株中包含seqidno.1所示核苷酸序列。

一种产磷脂酶d的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将seqidno.1所示核苷酸序列导入载体中，得到重组质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组质粒导入宿主菌中，既得到产磷脂酶d的基因工程菌。

步骤(1)中，所述载体为pet22b。

步骤(2)中，所述宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)。

上述产磷脂酶d的基因工程菌在发酵产磷脂酶d中的应用。

一种磷脂酶d的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1a)将产磷脂酶d的基因工程菌接种于种子培养基中，37℃、180～200r/min培养至对数生长期，作为种子液；

(2a)将步骤(1a)中得到种子液接种到发酵培养基中，37℃、180～200r/min培养至od600＝0～1.2，再添加iptg至终浓度0.001～0.1mm，于18～37℃，180～200r/min条件下诱导培养3～30h；

(3a)将(2a)中所得发酵液离心，留上清，即得到磷脂酶d粗酶液，进一步纯化既得到磷脂酶d。

步骤(1a)中，所述种子培养基配方如下：nacl5g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，ph7.2～7.4，溶剂为水；

步骤(2a)中，所述发酵培养基的配方如下：蛋白胨12g/l，酵母提取物24g/l，甘油0.4％(v/v)，kh2po40～170mm，k2hpo40～720mm，溶剂为水。

上述磷脂酶d的制备方法制备得到的磷脂酶d。

上述磷脂酶d在制备磷脂酰丝氨酸中的应用。

有益效果：

本发明通过对来源于streptomycessp.(strainpmf)的磷脂酶d进行密码子优化得到可以在大肠杆菌中正常表达的基因序列，并构建产磷脂酶d的重组大肠杆菌，通过酶活检测，经过优化的基因序列表达得到的磷脂酶d比优化之前的基因序列表达得到的磷脂酶d酶活提高了接近20倍，说明优化后的核苷酸序列更适于在大肠杆菌中表达。采用重组大肠杆菌所产磷脂酶d作为催化剂，酶来源方便，产量高，发酵工艺简单且成本低；该磷脂酶d催化生产磷脂酰丝氨酸，反应时间短，产率高，有一定应用前景。

附图说明

图1双信号肽质粒构建图。

图2质粒酶切验证图(泳道1.质粒经ncol，ecorl酶切验证泳道2.marker)。

图3反应4h产物ps与底物pc分析图。

图4反应12h产物ps与底物pc分析图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：重组大肠杆菌bl21(de3)-pet22b-pld的构建。

(1)以streptomycessp.(strainpmf)的基因组dna为模板，克隆得到磷脂酶基因，其碱基序列如seqidno.2所示；

(2)将(1)所得的磷脂酶d基因克隆到pet-22b(+)表达载体上，构建得到重组表达质粒；

(3)将(2)所得的重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，获得重组大肠杆菌bl21(de3)-pet22b-pld1。

实施例2：

种子培养基成分为：nacl5g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，ph7.4，121℃，灭菌20min。

发酵培养基成分为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl5g/l，121℃，灭菌20min。

将重组大肠杆菌bl21(de3)-pet22b-pld1接种于含氨苄青霉素50mg/ml的种子培养基中，于37℃，200r/min摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；再将种子液按5％的接种量接种到含氨苄青霉素50mg/ml的100ml发酵培养基中，于37℃，200r/min摇瓶培养至od600＝0.6，再添加iptg至终浓度0.05mm，于30℃，200r/min条件下诱导培养12h；将发酵液于4℃，8000r/min离心10min取上清得到磷脂酶d粗酶液。

将卵磷脂溶解在二氯甲烷中，浓度10g/l；将丝氨酸溶解在ph＝5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，与上述方法制得的磷脂酶d的1:1混合，丝氨酸浓度105g/l；按1：1的比例混合上述所得的溶液，形成两相反应体系；在200r/min转速下，进行转脂反应，反应时间为1～24h。

高效液相色谱蒸发光法检测得到磷脂酰丝氨酸0.4g/l，磷脂酶d酶活每毫升发酵液1.5u。

高效液相色谱蒸发光检测，色谱柱为安捷伦zorbaxrx-sil正向硅胶色谱柱(250mm×4.6mm×5um)。具体条件为：流动相a:85％甲醇，14.5％水，0.45％乙酸，0.05％三乙胺，流动相b:20％正己烷，48％异丙醇，32％流动相a。采用梯度洗脱，条件如下：初始2％a,5min：10％a,9min：30％a，11min：10％a，14min：10％a，17min:2％a。流速1ml/min，柱温：38℃；进样量：10ul。检测使用蒸发光散射检测器，检测温度72℃，漂移管温度72℃，氮气流速2.0slm。

实施例3：磷脂酶d基因密码子优化

(1)将来源于streptomycessp.(strainpmf)的磷脂酶d基因进行大肠杆菌密码子优化，得到优化后的磷脂酶d基因，其序列如seqidno.1所示：

(2)将(1)所得的磷脂酶d基因克隆到pet-22b(+)表达载体上，构建得到重组表达质粒；

(3)将(2)所得的重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，获得重组大肠杆菌bl21(de3)-pet22b-pld2。

实施例4：

种子培养基成分为：nacl5g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，ph7.4，121℃，灭菌20min。

发酵培养基成分为：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl5g/l，121℃，灭菌20min。

将重组大肠杆菌bl21(de3)-pet22b-pld2接种于含氨苄青霉素50mg/ml的种子培养基中，于37℃，200r/min摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；再将种子液按5％的接种量接种到含氨苄青霉素50mg/ml的100ml发酵培养基中，于37℃，200r/min摇瓶培养至od600＝0.6，再添加iptg至终浓度0.05mm，于30℃，200r/min条件下诱导培养12h；将发酵液于4℃，8000r/min离心10min取上清得到磷脂酶d粗酶液。将卵磷脂溶解在二氯甲烷中，浓度10g/l；将丝氨酸溶解在ph＝5.5的醋酸-醋酸钠缓冲和上述方法制得的磷脂酶d的混合溶液中，丝氨酸浓度105g/l；按1：1的比例混合上述所得的溶液，形成两相反应体系；在200r/min转速下，进行转脂反应，反应时间为1～24h。

高效液相色谱蒸发光法检测得到磷脂酰丝氨酸9.22g/l，磷脂酶d酶活每毫升发酵液36.8u。

高效液相色谱蒸发光检测，色谱柱为安捷伦zorbaxrx-sil正向硅胶色谱柱(250mm×4.6mm×5um)。具体条件为：流动相a:85％甲醇，14.5％水，0.45％乙酸，0.05％三乙胺，流动相b:20％正己烷，48％异丙醇，32％流动相a。采用梯度洗脱，条件如下：初始2％a,5min：10％a,9min：30％a，11min：10％a，14min：10％a，17min:2％a。流速1ml/min，柱温：38℃；进样量：10ul。检测使用蒸发光散射检测器，检测温度72℃，漂移管温度72℃，氮气流速2.0slm。

实施例5：

种子培养基成分为：nacl5g/l，蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，ph7.4，121℃，灭菌20min。

发酵培养基成分为：蛋白胨12g/l，酵母提取物24g/l，甘油0.4％(v/v)，kh2po4170mm，k2hpo4720mm，121℃，灭菌20min。

将重组大肠杆菌bl21(de3)-pet22b-pld2接种于含氨苄青霉素50mg/ml的种子培养基中，于37℃，180r/min摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；再将种子液按1％的接种量接种到含氨苄青霉素50mg/ml的100ml发酵培养基中，于37℃，180r/min摇瓶培养至od600＝1.0，再添加iptg至终浓度0.05mm，于27℃，180r/min条件下诱导培养10h；将发酵液于4℃，8000r/min离心10min，收集发酵液上清。

将卵磷脂溶解在二氯甲烷中，浓度30g/l；将丝氨酸溶解在ph＝5.5的醋酸-醋酸钠缓冲和上述方法制得的磷脂酶d的混合溶液中，浓度105g/l；按1：1的比例混合上述所得的溶液,形成两相反应体系；在200r/min转速下，进行转脂反应，反应时间为1～24h。得到磷脂酰丝氨酸19.24g/l，磷脂酶d酶活每毫升发酵液24.61u。

实施例6：

种子培养基成分为：nacl5g/l，蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，ph7.4，121℃，灭菌20min。

发酵培养基成分为：蛋白胨12g/l，酵母提取物24g/l，甘油0.4％(v/v)，kh2po4170mm，k2hpo4720mm，121℃，灭菌20min。

将重组大肠杆菌bl21(de3)-pet22b-pld2接种于含氨苄青霉素50mg/ml的种子培养基中，于37℃，180r/min摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；再将种子液按1％的接种量接种到含氨苄青霉素50mg/ml的100ml发酵培养基中，于37℃，180r/min摇瓶培养至od600＝0.7，再添加iptg至终浓度0.05mm，于27℃，180r/min条件下诱导培养10h；将发酵液于4℃，8000r/min离心10min，收集发酵液上清。

将卵磷脂溶解在二氯甲烷中，浓度50g/l；将丝氨酸溶解在ph＝5.5的醋酸-醋酸钠缓冲和上述方法制得的磷脂酶d的混合溶液中，浓度105g/l；按1：1的比例混合上述所得的溶液,形成两相反应体系；在200r/min转速下，进行转脂反应，反应时间为1～24h。得到磷脂酰丝氨酸23.96g/l，磷脂酶d酶活每毫升发酵液30.19u。

sequencelisting

<110>南京工业大学

<120>一株产磷脂酶d的基因工程菌及其构建方法与应用

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<223>密码子优化后的磷脂酶d基因序列

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<223>密码子优化前的磷脂酶d基因序列

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