一类红光与近红外发射溶酶体靶向荧光染料及其制备方法与用途与流程

本发明涉及可用于生物荧光分析领域的一类新型红光与近红外发射溶酶体靶向荧光染料及其制备与用途。

背景技术：
、

溶酶体直径约500nm，它是哺乳动物最为重要的末端降解区细胞器。溶酶体参与许多生理过程，如骨和组织重塑，质膜修复和体内胆固醇平衡，以及细胞信号传导和细胞凋亡，此外，溶酶体会显著增加相关生物酶的表达和活性，大部分相关肿瘤的发病和转移也会随着溶酶体的转运而改变。因此有效的荧光技术标记癌细胞的溶酶体对研究溶酶体转运具有重要意义。

为了了解溶酶体的一系列复杂生理活动，有限的几种有机荧光染料例如甲苯红和吖啶橙(n，n，n'，n'-四甲基吖啶-3,6-二胺)已经被开发出来，但是，这些商业化溶酶体染料具有相当短的激发波长，相当短的发射波长，穿透深度浅，需要生物分子固定，ph敏感，水溶解性差，光稳定性差等缺点限制了其在组织成像中的应用，此外，发射波长较长(600-1000nm)光的荧光染料具有光毒性低、高度局部激发和能延长观测时间等优点，能为学习研究提供强大的分析工具。因此，这些现状激励了我们开发新的红色荧光和红外荧光成像的溶酶体靶向染料。

以荧光染料为核心的荧光显微成像技术具有多分子对象并行观测能力和高时空分辨能力，使其成为在复杂生物体中研究溶酶体数量、大小、形状、结构变化方面极具应用前景的研究手段。其中红色荧光发射以及近红外(nir)荧光发射在生物学中的应用极大地增强了生物活体检测和光学成像的灵敏度，因为监测红色荧光、nir荧光可以最大限度地减少来自生物组织的自发荧光的干扰。最普遍的红色荧光、nir荧光染料是有机染料，如花菁类染料，这些有机分子的nir光谱由其π-π共轭结构的大小决定。基于这一原理，已经设计并合成了不同发射波长的各种红光和nir染料，用于生物成像和监测。

有机红光、nir荧光染料是生物成像材料中非常具有吸引力的候选者，改进后的有机红光、nir染料具有优秀的光物理性质并可用于大规模的化学合成。某些有机染料还表现出与生物成像中的各种物质如化学小分子、氨基酸、蛋白质、核苷酸、dna引物、双链dna和抗体的特异性结合的特性。由于存在与癌症靶向的生物有机分子作用的可能性，有机红光、nir染料被寻求作为更合适材料来特异地成像肿瘤细胞的溶酶体。

与一般的溶酶体荧光成像染料相比，吗啉吲哚基团是一种非常优秀的溶酶体靶向定位基团，通过与一些优良的荧光基团缩合反应，我们获取了一批新型的性能优异的溶酶体靶向荧光染料，这对进一步准确监测和分析溶酶体复杂生理活动极具指导意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一克服现有技术中用于细胞内溶酶体靶向定位荧光染料的性能和结构上的不足，提供一类结构新颖、性能优良，适用于活细胞溶酶体靶向成像的，以吗啉吲哚为溶酶体定位基团的荧光化学传感器，尤其是用于细胞内溶酶体的成像的新型荧光染料。

本发明的目的之二是提供一类红光与近红外发射溶酶体靶向荧光染料的合成方法。

本发明的目的之三是提供一类红光与近红外发射溶酶体靶向荧光染料的用途。

本发明的一类红光与近红外发射溶酶体靶向荧光染料，其特征在于：所述的荧光探针是具有以下结构的化合物：

其中：r分别或者同时独立的为1～18个碳的烷基、芳基、硝基、酯基或者醚基中的一种或苯、萘、蒽、芘、吡啶、吡咯、吲哚、苯并吲哚、香豆素、荧光素、bodipy、咔唑、罗丹明、芴、喹啉及其衍生物；n为0～20的整数；

本发明的一类红光与近红外发射溶酶体靶向荧光染料的合成方法，其特征是：将带有取代基r的化合物溶解在无水有机溶剂中，在有或无催化剂条件下加入吗啉吲哚醛，其中，吗啉吲哚醛与带有取代基r的化合物的摩尔比值为1～10:1；在反应温度为25～200℃下反应1～24小时，将溶液浓缩后，利用硅胶柱层析得到目标化合物。

其中：所述的带有取代基为r的化合物中具有活泼的甲基或亚甲基，r分别或者同时独立的为1～18个碳的烷基、芳基、硝基、酯基或者醚基中的一种或苯、萘、蒽、芘、吡啶、吡咯、吲哚、苯并吲哚、香豆素、荧光素、bodipy、咔唑、罗丹明、芴、喹啉及其衍生物；

所述的吗啉吲哚醛中的烷基是含有1～12个碳的烷基链或1～8个碳的苯、萘、蒽、吡啶、吡咯、芘、吲哚、香豆素及其衍生物的一种，其中的1～10个碳的烷基被卤素取代；

所述的催化剂是吡啶、六氢吡啶、三乙胺、碳酸钾中的一种；

所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲亚砜、乙腈、二氧六环、二氯甲烷、苯、甲苯、乙二醇单甲醚所组成的组中的至少一种。

本发明的一类红光与近红外发射溶酶体靶向荧光染料能够用于活细胞中溶酶体的靶向成像；也可用于合成检测活细胞中溶酶体生理环境变化的荧光探针以及溶酶体靶向的亚细胞级的激光染料。

本发明的一类红光与近红外发射溶酶体靶向荧光染料在使用时没有特殊的限制，可以将荧光染料溶解在生理盐水或羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)的缓冲水溶液或磷酸盐(pbs)的缓冲水溶液中；或者将染料分子溶解在甲醇、乙醇、乙腈、二甲亚砜、二甲酰胺任一有机溶剂中；或者水和上述任一有机溶剂任意比例的混合溶剂，然后取适量溶解有染料分子的上述溶液中加入含胎牛血清细胞培养液中，混合均匀后直接用于细胞孵育。

本发明提供了一种以吗啉吲哚为母体，用于活细胞中溶酶体靶向成像的荧光染料。该荧光染料对溶酶体有很好的靶向性，具有结构稳定、光稳定性好、荧光量子产率高以及毒性低等特性，对细胞中的复杂的生理环境(ph、粘度、阳离子、阴离子、大分子蛋白)具有良好的抗干扰性，表现出良好的实际应用能力。本发明的荧光染料溶剂化效应低，染色时间短，染色所需浓度低，光稳定性高，分子结构简单，合成方法简便，使得其极易实际推广应用。

附图说明

图1为实施例1制备的荧光染料1的氢核磁图谱，横坐标为化学位移，纵坐标为信号强度。

图2为实施例1制备的荧光染料1紫外可见吸收和荧光发射光谱，横坐标为波长，纵坐标为吸光度和荧光强度。

图3为实施例2制备的荧光染料2紫外可见吸收和荧光发射光谱，横坐标为波长，纵坐标为吸光度和荧光强度。

图4为实施例2制备的荧光染料2光稳定性光谱，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图5为实施例3制备的荧光染料3对细胞活力影响大小图片，横坐标为染料浓度，纵坐标为细胞存活率。

图6为实施例1制备的荧光染料1在肿瘤细胞内与商业化溶酶体靶向染料ltg的激光共聚焦成像图，a为商业化溶酶体靶向染料ltg细胞染色图片，b为染料4细胞染色图片，c为二者叠加图片，d为细胞画箭头部分荧光强度-位置关系图。

图7为实施例3制备的荧光染料3在肿瘤细胞内与商业化溶酶体靶向染料ltg激光共聚焦成像图，a为商业化溶酶体靶向染料ltg细胞染色图片，b为染料6细胞染色图片，c为二者叠加图片，d为细胞画箭头部分荧光强度-位置关系图。

具体实施方式

本发明公开了一类红光与近红外发射溶酶体靶向荧光染料，该荧光染料具有以下结构：

下面通过实施例对本发明做进一步说明，以下实施例通过化合物ⅰ和化合物ⅱ实现，其中化合物ⅰ：苯酚基bodipy,分子式c20h19bf2n2o,分子量341,常温下为橙红色固体,易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂。

化合物ⅱ：dibodipy(5,5,12,12-tetrafluoro-1,3,8,10-tetramethyl-5h,12h-5λ⁴,6λ⁴,12λ⁴,13λ⁴-pyrrolo[1,2-d]pyrrolo[1',2':4,5][1,2,4,3]triazaborinino[2,1-a][1,2,4,3]triazaborinine),分子式c14h16b2f4n4，分子量338，常温下为橙黄色固体，易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂。

实施例1：

称取化合物ⅰ和吗啉吲哚醛于三口瓶中，其摩尔比为1:1.5,加入30ml无水甲苯作为溶剂。然后，通入氮气，待反应加热到110℃后依次加入哌啶和冰乙酸。该反应混合物在氮气氛围中回流16小时后，减压蒸馏除去溶剂，将所得残留物通过柱层析(ch2cl2/c2h5oh＝60/1)纯化，得到深蓝色固体目标染料1。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.82(s,1h),7.93(s,2h),7.79(d,j＝16.4hz,1h),7.62(d,j＝7.2hz,1h),7.46(d,j＝16.4hz,1h),7.28(m,2h),7.15(d,j＝8.2hz,2h),6.99(s,1h),6.93(d,j＝8.2hz,2h),6.10(s,1h),4.38(t,j＝5.7hz,2h),3.56(s,4h),2.70(s,2h),2.48(s,6h),1.50(s,3h),1.42(s,3h).

¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ158.47,155.61,151.25,143.37,139.94,139.55,137.75,133.39,132.80,131.22,129.87,125.95,125.19,123.12,121.52,120.48,120.18,118.27,116.39,113.78,113.59,111.46,66.64,57.99,53.73,43.49,15.01,14.73,14.47.

图1为实施例1制备的荧光染料1的氢核磁图谱，横坐标为化学位移，纵坐标为信号强度。该图说明：经过本发明的反应提纯与核磁氢谱碳谱的归属分析(如上)，我们成功合成了目标荧光染料1.

图2为实施例1制备的荧光染料1紫外可见吸收和荧光发射光谱，横坐标为波长，纵坐标为吸光度和荧光强度。该图说明：我们成功合成了具有红光发射的目标荧光染料1，其最大吸收波长为590nm，最大发射波长为645nm，其斯托克斯位移达到了55nm。

实施例2：

称取化合物ⅰ和吗啉吲哚醛于三口瓶中，其摩尔比为1:5.5,加入30ml无水乙二醇甲醚作为溶剂。然后，通入氮气，待反应加热到140℃后依次加入哌啶和冰乙酸。该反应混合物在氮气氛围中回流24小时后，减压蒸馏除去溶剂，将所得残留物通过柱层析(ch2cl2/c2h5oh＝40/1)纯化，得到深绿色固体目标染料2。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.81(s,1h),8.07(d,j＝7.6hz,2h),7.88(s,2h),7.65(m,6h),7.32(dt,7.6hz,4h),7.19(d,j＝8.4hz,2h),6.94(m,4h),4.38(t,j＝6.4hz,4h),3.56(t,j＝4.8hz,8h),2.72(t,j＝6.4hz,4h),2.47(s,8h),1.51(s,6h).

¹³cnmr(125mhz,dmso-d6):δ158.44,152.83,140.98,137.93,136.85,133.03,132.97,130.66,130.27,125.93,125.53,123.08,121.16,120.42,117.29,116.34,114.63,114.11,111.43,66.72,58.03,53.81,43.61,14.83.

图3为实施例2制备的荧光染料2紫外可见吸收和荧光发射光谱，该图说明：我们成功合成了具有近红外发射的目标荧光染料2，其最大吸收波长为690nm，最大发射波长为735nm，其斯托克斯位移达到了45nm。

图4为实施例2制备的荧光染料2光稳定性光谱，该图说明:我们成功合成的目标近红外荧光染料2具备非常优越的荧光稳定性，在300min的持续照射下荧光强度几乎保持不变，达到了预期的要求。

实施例3：

称取化合物ⅱ和吗啉吲哚醛于三口瓶中，其摩尔比为1:3,加入30ml无水甲苯作为溶剂。然后，通入氮气，待反应加热至110℃后依次加入哌啶和冰乙酸。该反应混合物在氮气氛围中回流4小时后，减压蒸馏除去溶剂，将所得残留物通过柱层析(ch2cl2/c2h5oh＝55/1)纯化，得到深蓝色固体目标染料3。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.10(s,1h),7.91(dd,1h),7.22(d,1h),7.14(d,1h),7.05(s,1h),6.99(s,2h),6.87(dd,1h),6.10(s,1h),5.70(s,1h),3.95(t,1h),3,64(t,2h),2.66(t,1h),2.48(t,2h),2.16(s,1h),2.08(s,2h).

¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δ159.28,153.16,150.19,146.92,145.12,136.68,133.42,132.08,129.89,128.28,125.94,125.02,122.56,122.22,121.56,120.78,119.53,114.54,110.96,66.79,57.06,53.10,46.57,16.08,12.63.

实施例4：

请参见图5。荧光染料3细胞毒性大小图片。

向96孔板中各孔中加入100μl细胞悬液，在37℃下预孵育培养板24小时。接着向各孔中加入各浓度的荧光染料3的溶液10μl，37℃下孵育24小时。最后向各孔中加入10μl的cck-8溶液。37℃下孵育4小时。然后测定450nm处的od值,采用cck-8方法计算含有不同浓度染料的培养基培养24小时后的细胞存活率。其结果表明荧光染料3在2.5-25μl范围内毒性较低具有良好生物相融性。

实施例5：

请参见图6。荧光染料1对与商业化的溶酶体靶向染料(lysotrackergreen)共定位成像的图片。

用少量二甲基亚砜溶解染料1及lysotrackergreen染料后，加入到培养基中，最终配置成含有10μm浓度的荧光染料a和1.0μm浓度的lysotrackergreen的混合物，用移液枪移取3ml加入培养皿中，将其放入培养箱中培养30min后，用pbs洗涤三次，再加入1ml空白混合培养基进行荧光共聚焦成像,结果表明染料a具有膜的通透性，对细胞内溶酶体具有良好的靶向性。

实施例6：

请参见图7。荧光染料3对与商业化的溶酶体靶向染料(lysotrackergreen)共定位成像的图片。

用少量二甲基亚砜溶解染料3及lysotrackergreen染料后，加入到培养基中，最终配置成含有10μm浓度的荧光染料a和1.0μm浓度的lysotrackergreen的混合物，用移液枪移取3ml加入培养皿中，将其放入培养箱中培养30min后，用pbs洗涤三次，再加入1ml空白混合培养基进行荧光共聚焦成像,结果表明染料a具有膜的通透性，对细胞内溶酶体具有良好的靶向性，且荧光发射区在近红外区。

本发明实施例仅是用于对本发明保护的技术方案做进一步的解释说明，并未涵盖本发明保护方案中所有原料组成及含量。需要进一步明确的是，本发明保护方案中所公开的任一原料组成、催化剂、有机溶剂所制备的目标产品荧光染料，均可达到实施例中目标产品相同的效果。