肺表面活性蛋白B前肽的重组蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种肺表面活性蛋白b前肽的重组蛋白、编码该重组蛋白的核酸、一种重组质粒、一种重组菌株、一种制备肺表面活性蛋白b前肽的重组蛋白的方法以及它们的应用。
背景技术：
：自从抗生素被发现以来，在人类疾病治疗过程中发挥了重大的作用，治愈了许多人类束手无策的感染性疾病，挽救了许多人的生命，大大的提高了人类的平均寿命。然而由于它们的大量使用、滥用及不规范使用等原因，致使大量的耐药菌株出现、传播，导致感染性疾病的治疗复杂化，治疗费用增长，发病率、死亡率增加，使得感染菌的耐药性成为一个不可回避的问题。并且这些传统的抗感染药物还具有耳毒性、肾毒性、肝毒性、神经毒性、心脏毒性、变态反应及对造血系统成造成损伤等许多明显的毒副作用，从而对患者造成一些不可预见的影响，甚至会危及患者的生命。由于传统抗生素药物的诸多不利因素，因此寻找抗生素的有效替代品，开发出新的毒性低且效果好的抗菌药物具有现实的意义。而抗菌肽作为一类新型的抗菌药物，近几年来的发展十分迅猛。其中，肺表面活性物质由于是由人体自身细胞所表达、分泌的物质，且可能具有抗炎抗菌活性，因此，以肺表面活性物质为基础开发出一类抗菌药物具有重大前景。肺表面活性蛋白(surfactantprotein，sp)作为肺表面活性物质中最为重要的物质之一，特别是其中的sp-b蛋白的抗菌作用，越来越受到人们的关注。但是，marnie等研究发现成熟的sp-b蛋白的抗菌作用仅发生于体外，在机体内，成熟sp-b与磷脂质相互关联，磷脂质与sp-b的结合较为稳定，不能使得sp-b作用于外来的细菌来发挥其抗菌功能，并且成熟的sp-b非选择性的作用于磷脂分子层，裂解细胞膜，表现出非选择性的溶解体细胞，特别是红细胞，造成溶血等机体损伤。因此，人们又将目光转移到肺表面活性蛋白b前肽(prosurfactantprotein-b，prosp-b)上，但是，prosp-b由于具有较强的疏水性，很难通过化学合成方式获得，这增加了对该类物质的进一步开发和研究。因此，目前急需寻找一种获得具有良好抗菌活性的prosp-b的方法，以为开发出既可以克服传统抗生素的诸多缺陷，又具有良好抗菌效果的新型抗菌药奠定基础。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种prosp-b的重组蛋白，编码该重组蛋白的核酸、重组质粒、重组菌株和制备prosp-b的重组蛋白的方法以及它们的应用。采用本发明提供的方法，成功地获得了prosp-b重组蛋白，该prosp-b重组蛋白的细胞毒性低，且表现出良好的抗菌活性。为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种肺表面活性蛋白b前肽的重组蛋白，其中，所述重组蛋白具有seqidno：1所示的氨基酸序列，或者在seqidno：1的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列。第二方面，本发明还提供了能够编码上述重组蛋白的核酸。第三方面，本发明还提供了一种重组质粒，该重组质粒含有上述核酸。第四方面，本发明还提供了一种重组菌株，该重组菌株含有上述重组质粒。第五方面，本发明还提供了一种制备肺表面活性蛋白b前肽的重组蛋白的方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)将上述的重组质粒转化至表达宿主菌中，以得到重组菌株；(2)所述重组菌株经培养后，在诱导剂的存在下进行诱导培养，以得到培养液；(3)将由步骤(2)得到的培养液进行纯化和标签去除，以得到肺表面活性蛋白b前肽的重组蛋白。上述重组蛋白、核酸、重组质粒、重组菌株、以及上述的方法制备得到的重组蛋白在制备抗菌药中应用；优选地，所述抗菌药为抗金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、大肠杆菌(escherichiacoli)、石膏样小孢子菌(microsporumgypseum)、白色念珠菌(moniliaalbican)、红色毛癣菌(trichophytonrubrum)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus)中的至少一种的药物。prosp-b由于具有较强的疏水性，很难通过化学合成方式获得，本发明采用基因工程方法，特别是通过使用特定的表达载体(pgex4t-1)和表达宿主菌(大肠杆菌bl21(de3)plyss菌株)，成功地获得了浓度较高的prosp-b重组蛋白，并且，通过将pgex4t-1载体上的gst标签与prosp-b融合，由于gst标签具有亲水性，可以明显提高prosp-b重组蛋白的水溶性，扩大其应用范围。另外，本发明提供的prosp-b重组蛋白表现出良好的广谱抗菌活性，其对临床上常见的细菌、真菌均具有较强的抑制作用，特别是对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌、红色毛癣菌、铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表现出明显的抑制活性。进一步的研究发现，prosp-b重组蛋白发挥其抗菌作用的可能是通过影响细菌细胞膜的通透性，从而抑制细菌的正常生长。同时，本发明提供的prosp-b重组蛋白的细胞毒性较小，即使将蛋白浓度提高到1mg/ml(该浓度远远大于其对细菌的mic值)，细胞的增殖能力依然高于59％，这说明本发明提供的prosp-b重组蛋白具有较高的安全性。附图说明图1显示的是本发明的实施例1中pcr产物鉴定的结果；图2显示的是本发明的实施例1中重组质粒pet30-prosp-b的鉴定结果；图3显示的是本发明的实施例1中重组质粒pgex4t-1-prosp-b的鉴定结果；图4显示的是本发明的实施例1中prosp-b重组蛋白诱导表达的sds-page结果；图5显示的是本发明的实施例1中prosp-b重组蛋白诱导表达的western-blot结果；图6显示的是本发明的实施例1中诱导表达的prosp-b重组蛋白经纯化后的sds-page和sds-page；图7显示的是本发明的实施例3中prosp-b重组蛋白的抗菌谱测定的结果。具体实施方式在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。第一方面，本发明提供了一种肺表面活性蛋白b前肽的重组蛋白，其中，所述重组蛋白具有seqidno：1所示的氨基酸序列，或者在seqidno：1的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列。seqidno：1所示的氨基酸序列为：agandlcqecedivhlltkmtkedafqdtirkfleqecdilplkllvprcrqvldvylplvidyfqgqikpkaicshvglc。在本发明中，所述“连接有标签的氨基酸序列”是指使用本领域常见的标签对seqidno：1所示的氨基酸序列进行添加和修饰。考虑到prosp-b具有较强的疏水性，在优选的情况下，所述标签具有亲水性。更优选地，所述标签为gst标签。在本发明中，所述gst(glutathiones-transferase，谷胱甘肽s-转移酶)标签可以是本领域常规使用的gst标签，其可以通过表达载体引入。在优选的情况下，所述gst标签的氨基酸序列的genbank号为：amq34028.1(具体请参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1005883217)。第二方面，本发明还提供了一种能够编码上述重组蛋白的核酸。根据本发明，所述核酸具有seqidno：2所示的核酸序列，或者在seqidno：2的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的核酸序列；优选地，所述标签具有亲水性；更优选地，所述标签为gst标签。seqidno：2所示的核酸序列为：gcaggagctaatgacctgtgccaagagtgtgaggatattgtccacctcctcacaaagatgaccaaggaagacgctttccaggacacgatccggaagttcctggaacaagaatgtgatatcctacccttgaagctgcttgtgccccggtgtcgccaagtgcttgatgtctacctgcccctggttatcgactacttccagggccagattaaacccaaagccatctgcagtcatgtgggcctgtgc。在本发明中，由于本发明提供的核酸具有较强的疏水性，很难通过人工合成法获得，因此，本发明提供的核酸通常采用基因工程方法获得，例如，可以通过聚合酶链式反应(pcr)扩增法获得。具体地，本领域技术人员可以根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和相应的引物，利用pcr进行扩增获得有关序列。一旦获得了有关核酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核酸序列克隆入表达载体，再转入表达宿主菌中，然后通过常规的方法从增殖后的表达宿主菌分离得到有关核酸序列。在本发明中，所述“连接有标签的核酸序列”是指使用本领域常见的标签对seqidno：2所示的核酸序列进行添加和修饰。考虑到prosp-b具有较强的疏水性，在优选的情况下，所述标签具有亲水性。更优选地，所述标签为gst标签。在本发明中，所述gst标签可以是本领域常规使用的gst标签，其可以通过表达载体引入，优选通过pgex4t-1质粒引入。在优选的情况下，所述gst标签的核酸序列为genbank号：ku312308.1的第258位至第959位所示的序列。第三方面，本发明还提供了一种重组质粒，该重组质粒含有上述核酸。在本发明中，所述重组质粒使用的质粒优选为pet30a质粒和/或pgex4t-1质粒(均可以通过商购手段获得)。所述重组质粒可以采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，然后与采用相同核酸内切酶切割的核酸片段连接，获得重组质粒。例如，对于pet30a质粒，可以使用xholi、noti、eagi、hindiii、ecori、bamhi、ncoi、kpni、bgiii、ndei等内切酶；对于pgex4t-1质粒，可以使用xholi、noti、ecori、bamhi、smai等内切酶。在本发明的一种优选的实施方式中，所述重组质粒为在pgex4t-1质粒的bamhi和xhoi酶切位点之间插入seqidno：2所示的核酸序列而得到的表达载体。第四方面，本发明还提供了一种重组菌株，其中，该重组菌株含有上述重组质粒；优选地，所述重组菌株为含有上述重组质粒大肠杆菌bl21(de3)plyss菌株本发明可以采用本领域常规使用的方法将重组质粒转化进入表达宿主菌中，以获得重组菌株。例如，可以使用热激法、氯化钙化学转化法等，优选为热激法。在本发明中，所述表达宿主菌可以为本领域常规使用的任意适于作为宿主的细菌或真菌，例如，可以为大肠杆菌。优选地，用于保存重组质粒的大肠杆菌dh5α菌株，用于表达的大肠杆菌bl21(de3)plyss菌株。本发明使用的表达宿主菌均可以通过常规的商购手段获得。第五方面，本发明还提供了一种制备肺表面活性蛋白b前肽的重组蛋白的方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)将上述重组质粒转化至表达宿主菌中，以得到重组菌株；(2)所述重组菌株经培养后，在诱导剂的存在下进行诱导培养，以得到培养液；(3)将由步骤(2)得到的培养液进行纯化和标签去除，以得到肺表面活性蛋白b前肽的重组蛋白。在本发明中，在步骤(1)中，可以采用本领域常规使用的方法将重组质粒转化进入表达宿主菌中，以获得重组菌株。例如，可以使用热激法、氯化钙化学转化法等，优选为热激法。在本发明中，在步骤(1)中，所述表达宿主菌可以为本领域常规使用的任意适于作为宿主的细菌或真菌，例如，可以为大肠杆菌。优选地，用于保存重组质粒的表达宿主菌为大肠杆菌dh5α菌株，用于表达的表达宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)plyss菌株。本发明使用的表达宿主菌均可以通过常规的商购手段获得。在本发明中，在步骤(2)中，本发明对所述诱导剂的种类没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，例如，所述诱导剂可以为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，且所述诱导剂的浓度为0.5-2mmol/l，优选为0.8-1.5mmol/l。在本发明中，在步骤(2)中，本发明对所述诱导培养的条件没有特别的限定，只要能够达到诱导重组蛋白表达的目的即可。在优选的情况下，所述诱导培养的条件包括：温度为28-37℃，优选为28-35℃，更优选为28-32℃；时间为3h以上，优选为3-24h，更优选为12-24h。在本发明中，在步骤(3)中，本发明对所述纯化和标签去除的方式没有特别的限定，只要能够实现蛋白纯化和标签去除的目的即可，例如，可以通过吸附的方式进行蛋白纯化，可以使用蛋白酶进行标签去除。在本发明的一种具体的实施方式中，对于pgex4t-1质粒，使用gstrapff16/10预装柱(可以通过常规的商购手段获得)进行重组蛋白的纯化和标签去除。第六方面，本发明还提供了上述重组蛋白、上述核酸、上述重组质粒、上述重组菌株、由上述方法制备得到的重组蛋白在制备抗菌药中的应用；优选地，所述抗菌药为抗金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、大肠杆菌(escherichiacoli)、石膏样小孢子菌(microsporumgypseum)、白色念珠菌(moniliaalbican)、红色毛癣菌(trichophytonrubrum)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus)中的至少一种的药物；更优选地，所述抗菌药为抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌、红色毛癣菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的至少一种的药物；进一步优选地，所述抗菌药为抗金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物。在本发明所述的应用中，上述重组蛋白、上述核酸、上述重组质粒、上述重组菌株、由上述方法制备得到的重组蛋白在所述抗菌药中使用的ph值为3-8，优选为5-6，更优选为5.4-6。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。在以下实施例中：sd大鼠购于大坪医院野战外科研究所实验动物中心；大肠杆菌dh5α购自上海昂羽生物科技有限公司；大肠杆菌bl21(de3)plyss购自北京华越洋生物公司，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌、红色毛癣菌、铜绿假单胞菌购自北京北纳创联生物技术研究院、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(编号atcc43300)购自广东省微生物菌种保藏中心；ccl-149细胞株购自上海谷研生物科技公司；pgex4t-1购自上海友科生物技术有限公司；bamhi、hindiii、xhoi均购自美国neb公司；t4连接酶、总rna提取试剂盒、逆反转录试剂盒均购自美国genecopoeia公司；dna胶回收试剂盒、dnaloadingbuffer、dnamarker均购自日本takara公司；碘化丙啶(pi)购自上海翔圣生物科技有限公司；ldh试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。其余实验试剂和耗材均可以通过常规的商购手段获得。实施例1本实施例用于说明本发明提供的prosp-b重组蛋白的制备方法。1、大鼠肺组织总rna提取(1)使用总rna提取试剂盒(购于美国genecopoeia公司)提取大鼠肺组织总rna；(2)rna的电泳检测使用新配置的凝胶电泳液进行电泳，凝胶成像仪检测分析rna质量。2、prosp-b基因cdna的获得及扩增(1)获得cdna片段反转录反应体系：总rna1μgoli(dt)181μlfreernasewater至13μl于65℃下反应10min，然后于4℃下保存。反应体系：反应条件：于42℃下反应60min，再于85℃下反应5min，然后在4℃保存。最后将反转录的产物放在-80℃冰箱长期保存。(2)以cdna为模板进行pcr扩增(a)引物序列设计根据pet30a质粒图谱和bamhⅰ及hindⅲ酶切位点，用primerpremier5.0软件设计上、下游引物，其引物序列如下。prosp-b-f5'-aaaggatccgcaggagctaatgacctg-3'(seqidno：3)prosp-b-r5'-tttaagcttttagcacaggcccacatg-3'(seqidno：4)(b)反应液配制：(c)pcr反应条件：95℃反应5min；95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸45s，共39个循环；72℃延伸6min，4℃保存。(d)pcr产物鉴定pcr反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统上观察条带，分析结果。结果如图1所示，由图1可知在约250bp处出现条带，大小符合目的基因大小，初步证明反转录成功。(e)用pcr产物纯化回收试剂盒进行pcr产物的纯化。(3)pet30-prosp-b表达载体的构建、鉴定利用bamhi、hindiii对pet30和prosp-b片段进行双酶切，并切胶回收酶切产物，t4dna连接酶4℃过夜连接。(a)bamhi、hindⅲ双酶切反应体系：反应条件：恒温水浴锅，37℃，8h，琼脂糖凝胶电泳检测。(b)载体、目的片段切胶回收产物的切胶回收及纯化按dna纯化回收试剂盒说明书进行。(c)t4dna连接酶反应体系：(d)重组质粒的转化与鉴定：将10μl连接产物全部加入到100μl的大肠杆菌dh5α感受态中，运用pcr仪进行转化的质粒导入操作，过程如下：0℃反应30min，再于42℃反应30s，然后于0℃保存。然后往产物中加入300μl液体lb培养基，37℃、150r/min培养1h。然后涂布在含50μg/ml卡那的固体lb平板上，37℃过夜培养，然后挑取菌落进行菌落pcr鉴定，鉴定为阳性的菌落进行扩培提质粒，质粒pcr和双酶切鉴定。将鉴定为阳性的重组质粒命名为pet30-prosp-b，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果表明，该重组质粒序列的第187-429位与seqidno：2所示序列相一致。pcr结果如图2所示。具体地，将连接产物转化进入dh5α感受态细胞中，经含卡那的抗性平板筛选，其菌落pcr鉴定结果如图2(a)所示，菌落摇瓶质粒琼脂糖电泳结果如图2(b)所示，菌落质粒pcr鉴定结果如图2(c)所示，菌落质粒双酶切结果如图2(d)所示，由图可知，pcr结果均为单一条带，且其大小约250bp，与目的基因prosp-b大小吻合，双酶切图也显示在250bp处有单一条带，位置正确，与prosp-b大小符合，初步证明重组质粒pet30-prosp-b构建成功。并且，经在ncbi中blast的结果可知，阳性质粒的测序结果与prosp-b相匹配，这表明实验过程中构建的pet30-prosp-b载体构建成功。(4)pgex4t-1-prosp-b表达载体的构建、鉴定利用bamhi、xhoi对pgex4t-1和pet30-prosp-b质粒进行双酶切并切胶回收酶切产物，t4dna连接酶4℃过夜连接。(a)酶切反应体系：双酶切反应条件：恒温水浴锅，37℃，8h，琼脂糖凝胶电泳检测。(b)t4dna连接酶反应体系：(c)重组质粒的转化与鉴定：将连接产物转化到大肠杆菌dh5α感受态中，并进行菌落pcr鉴定。对鉴定为阳性的菌落进行扩培提质粒，质粒pcr和双酶切鉴定。将鉴定为阳性的重组质粒命名为pgex4t-1-prosp-b，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果表明，该重组质粒序列的第609-851位与seqidno：2所示序列相一致。pcr结果如图3所示。具体地，将连接产物转化进入dh5α感受态细胞中，经含氨苄的抗性平板筛选，其菌落pcr鉴定结果如图3(a)所示，菌落摇瓶质粒琼脂糖电泳结果如图3(b)所示，菌落质粒pcr鉴定结果如图3(c)所示，菌落质粒双酶切结果如图3(d)所示，由图可知，pcr结果均为单一条带，且其大小约250bp，与目的基因prosp-b大小吻合，双酶切图也显示在250bp处有单一条带，位置正确，与prosp-b大小符合，初步证明重组质粒pgex4t-1-prosp-b构建成功。并且，经在ncbi中blast的结果可知，阳性质粒的测序结果与prosp-b相匹配，这表明实验过程中构建的pgex4t-1-prosp-b载体构建成功。(5)prosp-b重组蛋白诱导表达及sds-page检测将测序结果显示正确的重组质粒pgex4t-1-prosp-b转化至大肠杆菌bl21(de3)plyss中。于37℃、250r/min过夜培养，次日以1:100的接种量转接于含amp50μg/ml的新鲜lb液体培养基中，37℃、250r/min振荡培养，当菌液od600约为0.8时，吸取部分菌液作为诱导前对照，12000r/min离心收集；菌液加入iptg诱导使其终浓度为1.0mmol/l，分别于30℃和37℃、250r/min振荡培养，并在3h、6h、9h、12h、24h收集菌体，用sds-page检测分析。sds-page配胶体系：sds-page条件：恒压进行电泳，其中浓缩胶为80v，分离胶为120v，待蛋白marker完全分开且占据单行胶的3/4时停止电泳。染色：将电泳完的胶去除浓缩胶，将分离胶置于考马斯亮蓝r250染色液中，室温水平摇床上染色1h；然后用脱色液进行脱色，使胶上考马斯亮蓝r250蓝色部分完全脱净，取出、拍照。结果如4所示。具体地，图4(a)显示的是分别于37℃和30℃诱导后的sds-page跑胶结果。其中，条带1显示的是未经诱导的菌体的蛋白表达结果；条带2显示的是37℃下诱导的菌体的蛋白表达结果；条带3显示的是30℃下诱导的菌体的蛋白表达结果；条带4显示的是30℃下菌体破碎上清的蛋白表达结果；条带5为蛋白marker。由图4(a)可知，在37℃条件下诱导所得的蛋白量没有30℃条件下诱导所得的量大，且菌体上清含有的蛋白量与全菌体的量基本一致，由此说明30℃时，重组蛋白以可溶性蛋白的形式存在，且于蛋白30℃下诱导较为合适。图4(b)显示的是30℃下诱导不同时间后蛋白表达的情况。其中，条带1为蛋白marker；条带2显示的是未经诱导的菌体的蛋白表达结果；条带3显示的是诱导3h后菌体上清的蛋白表达结果；条带4显示的是诱导6h后菌体上清的蛋白表达结果；条带5显示的是诱导9h后菌体上清的蛋白表达结果；条带6显示的是诱导12h后菌体上清的蛋白表达结果；条带7显示的是诱导24h后菌体上清的蛋白表达结果。由图4(b)可知，在30℃条件下，诱导3-24h，目的蛋白的表达量随着时间的增加而逐渐增加，到12h后增加趋势变缓。(6)westernblot检测prosp-b的表达当蛋白经sda-page分离后，依据蛋白marker位置剪下gst-prosp-b所在区域，转印至pvdf膜上，恒流电转，250ma，1h。用含5％脱脂奶粉的tbs-t封闭1h；进行兔抗大鼠prosp-b多克隆抗体(1∶10000稀释)4℃冰箱过夜孵育；第二天用tbs-t洗涤完后，用hrp标记山羊抗兔igg二抗(1∶5000稀释)室温孵育1h，再经tbs-t洗涤后滴加chemiluminescenthrpsubstrate发光液，用天能发光成像工作站成像。结果如图5所示，其中，条带1显示的是未经诱导的菌体的蛋白表达结果；条带2-7分别显示的是诱导3h、6h、9h、12h和24小时后菌体上清的蛋白表达结果。由图5可知，本发明得到的prosp-b重组蛋白条带为单一条带，无非特异性条带出现，且蛋白大小与预期一致，这说明表达的蛋白为prosp-b重组蛋白。(7)gst-prosp-b重组蛋白的纯化按1:100的接种量将重组菌株pgex4t-1-prosp-b接种于含amp50ug/ml的液体lb培养基中，30℃诱导12h后离心收集菌体。pbs(含0.1mmol/lpmsf)重悬菌体沉淀，超声处理10min，12000r/min离心20min收集上清，然后用0.45μm微孔滤膜过滤。蛋白用蛋白纯化系统进行纯化，其中纯化柱为gstrapff16/10预装柱。纯化后进行sds-page、westernblot检测分析，并用bca蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。经测定，重组蛋白的浓度约为1mg/ml。纯化后的sds-page、westernblot检测结果如图6所示。具体地，图6(a)显示的是蛋白经纯化后的sds-page结果，其中，条带1为蛋白marker；条带2显示的是于30℃下诱导12h后的菌体上清(纯化前)的结果；条带3显示的是于30℃下诱导12h后的菌体上清经纯化后的结果。图6(b)显示的是蛋白经纯化后的westernblot结果，其中，条带1为蛋白marker；条带2显示的是未诱导菌体上清的结果；条带3显示的是于30℃下诱导12h后的菌体上清经纯化后的结果。图6(a)和图6(b)的结果表明，纯化后可以获得表达量更高的重组蛋白(具有seqidno：1所示的氨基酸序列)。实施例2本实施例用于说明本发明提供的prosp-b重组蛋白的细胞毒性(1)使用含10％fbs的r/mini1640培养基培养ccl-149细胞。(2)将培养稳定的ccl-149细胞，用胰酶消化细胞，收集细胞并用培养基稀释调节细胞浓度，使其在100μl中约有5000个细胞，在96孔板第1～10孔中接种100μlccl-149细胞，在第11孔中加入100μl培养基，37℃、5％co2细胞培养箱中培养24h。(3)依次往96孔板的第1～9孔加入10μl浓度为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、21.25μg/ml、15.63μg/ml、7.81μg/ml、3.91μg/ml的由实施例1中步骤(7)获得的纯化后的蛋白，第10、11孔加入10μl灭菌蒸馏水。(4)将96孔板置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养12h。(5)往96孔板中每孔加入10μlcck-8溶液。(6)将96孔板在37℃、5％co2细胞培养箱中孵育4小时。(7)用酶标仪在450nm处测定吸光度值。(8)按下列公式计算细胞活力：ac：细胞被prosp-b重组蛋白溶液处理过的吸光度，即实验组；a0：不含细胞的吸光度，即空白组；as：有细胞，但细胞没被prosp-b重组蛋白溶液处理过的吸光度，即对照组。细胞毒性实验的结果如表1所示。表1由表1的结果可以计算出本发明提供的prosp-b重组蛋白的ic50＝1595.68μg/ml，具体地，当prosp-b重组蛋白的浓度为1mg/ml时，其细胞活力为59.62％，说明prosp-b重组蛋白的细胞毒性是较小的，根据细胞毒性评价标准—rgr毒性分级法，当细胞相对增殖率(rgr)≥75％时，可以判定药物毒性为0级或1级，当rgr在50％～74％间时，判定药物毒性为2级；其中2级及以下都说明药物的毒性是可接受的，即是安全的。当prosp-b重组蛋白的浓度提高至1595μg/ml时，其细胞增殖率也高于50％，说明prosp-b重组蛋白浓度为1595μg/ml时，其是低毒的，可以用于药物开发，而一般药物的治疗计量均低于1595μg/ml，因此本研究的对象prosp-b重组蛋白作为一类抗菌药物开发完全是安全的。实施例3本实施例用于说明本发明提供的prosp-b重组蛋白的抗菌活性1、菌种的活化和菌悬液的制备(1)金黄色葡萄球菌培养：用划线法将金黄色葡萄球菌活化于lb琼脂平板上，37℃、12h恒温培养，待长出单菌落后，挑取单菌落接种在10mllb液体培养基中，37℃、12h、150r/min，培养，移液枪吸取菌液与灭菌过的双蒸水制成菌悬液，调整其浓度，制得106cfu的菌悬液。(2)大肠杆菌的培养：用划线法将大肠杆菌活化于lb琼脂平板上，37℃、12h恒温培养，待长出单菌落后，挑取单菌落接种在10mllb液体培养基中，37℃、12h、150r/min，培养，移液枪吸取菌液与灭过菌的双蒸水制成菌悬液，调整其浓度，制得106cfu的菌悬液。(3)红色毛癣菌培养：配制sda培养基，倒入玻璃试管中，形成斜面，在斜面的上中下三个位置接种红色毛癣菌，28℃恒温培养10d，然后往每支试管中加入灭过菌的双蒸水2ml，使管中的红色毛癣菌分散于液体中，调整其浓度，制得106cfu的菌悬液。(4)石膏样小孢子菌的培养：配制sda斜面培养基平板，在斜面的上中下三个位置接种石膏样小孢子菌，28℃恒温培养10d，然后往每支试管中加入灭过菌的双蒸水2ml，使管中的石膏样小孢子菌分散于液体中，调整其浓度，制得106cfu的菌悬液。(5)白色念珠菌：用划线法将白色念珠菌活于lb琼脂平板上，28℃、10d恒温培养，待长出单菌落后，挑取单菌落接种在10mllb液体培养基中，37℃、12h、150r/min，培养，移液枪吸取菌液与灭过菌的双蒸水制成菌悬液，调整其浓度，制得106cfu的菌悬液。(6)铜绿假单胞菌：用划线法将铜绿假单胞菌活化于lb琼脂平板上，37℃、12h恒温培养，待长出单菌落后，挑取单菌落接种在10mllb液体培养基中，37℃、12h、150r/min，培养，移液枪吸取菌液与灭过菌的双蒸水制成菌悬液，调整其浓度，制得106cfu的菌悬液。(7)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：用划线法将保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活化于lb琼脂平板上，37℃、12h恒温培养，待长出单菌落后，挑取单菌落接种在10mllb液体培养基中，37℃、12h、150r/min，培养，移液枪吸取菌液与灭过菌的双蒸水制成菌悬液，调整其浓度，制得106cfu的菌悬液。2、prosp-b重组蛋白抑菌实验-ph值的优化(1)将配制好的蛋白缓冲液调节不同的ph值，制备成不同的蛋白缓冲液。(2)抑菌滤纸片的制备：制备好约6mm的圆形滤纸片，121℃灭菌20min，电热鼓风干燥箱干燥2h。将滤纸片用无菌镊子夹取放到500μg/ml由实施例1中步骤(7)得到的蛋白液中浸泡，将浸泡后的滤纸片分别放入无菌培养皿中，干燥表面多余液体，以得到浸药的滤纸片；并以无菌生理盐水为阴性对照，以青霉素或特比萘芬为阳性对照(细菌的阳性对照为青霉素，真菌的阳性对照为特比萘芬)。(3)菌种的涂布：移液枪吸取各稀释制备好的菌悬液50μl，玻璃涂布棒均匀的涂抹于各个固体平板上。(4)将含药滤纸片用无菌镊子将浸药的滤纸片、阴性对照滤纸片、阳性对照滤纸片贴于平板中，用记号笔在培养皿背面做好标记。(5)菌体培养：将贴了滤纸片的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌倒置于37℃细菌生化培养箱培养12h；红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌平板倒置于28℃细菌生化培养箱培养5d。(6)用直尺测量各平板的抑菌圈大小(单位mm)，结果如表2所示。统计分析，筛选合适的ph值。表2由表2的结果可知，prosp-b重组蛋白在ph3-8时均具有一定的抗菌活性，说明抗菌肽对弱酸性和弱碱性都具有一定的耐性。其中，在弱酸环境下，prosp-b重组蛋白的抗菌活性表现得更明显，当ph为5.6时，其抑菌效果最强，当ph>5.6时，其抑菌程度随ph值的增大而降低，这可能与蛋白的构象变化有关系，其在碱性环境下分子构象发生变化，而影响了抗菌肽的生物学活性，导致其抗菌活性的降低。3、prosp-b重组蛋白的抗菌谱测定(1)抑菌滤纸片的制备：制备好约6mm的圆形滤纸片，121℃灭菌20min，电热鼓风干燥箱干燥2h。将滤纸片用无菌镊子夹取放到500μg/ml由实施例1中步骤(7)得到的蛋白液中浸泡，将浸泡后的滤纸片分别放入无菌培养皿中，干燥表面多余液体，以得到浸药的滤纸片；并以无菌生理盐水为阴性对照，以青霉素或特比萘芬为阳性对照(细菌的阳性对照为青霉素，真菌的阳性对照为特比萘芬)。(2)菌种的涂布：移液枪吸取各稀释制备好的菌悬液50μl，玻璃涂布棒均匀的涂抹于各个固体平板上。(3)将含药滤纸片用无菌镊子将浸药的滤纸片、阴性对照滤纸片、阳性对照滤纸片贴于平板中，用记号笔在培养皿背面做好标记。(4)菌体培养：将贴了滤纸片的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌倒置于37℃细菌生化培养箱培养12h；红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌平板倒置于28℃细菌生化培养箱培养5d。(5)用直尺测量各平板的抑菌圈大小，(单位mm)，结果如图7(a为空白对照，b为阳性对照)和表3所示。具体在图7中，图7(a)显示的是金黄色葡萄球菌的结果；图7(b)显示的是大肠杆菌的结果；图7(c)显示的是白色念珠菌的结果；图7(d)显示的是红色毛癣菌的结果；图7(e)显示的是石膏样小孢子菌的结果；图7(f)显示的是铜绿假单胞菌的结果；图7(g)显示的是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的结果。然后进行统计分析，计算各菌的敏感程度，药敏实验的判定标准如表4所示。表3表4抑菌圈直径(mm)20以上15-1010-1410以下6以下敏感度极敏高敏中敏低敏不敏感由表3和图7可知，prosp-b重组蛋白对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌均具有较强的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，其抑菌圈大小分别达到20.6mm、20mm，所以金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对于蛋白浓度为500μg/ml时都是极敏的；而对大肠杆菌的抑制作用较强，其抑菌圈大小达到15.3mm，所以大肠杆菌的对于蛋白浓度为500μg/ml时是高敏的；红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌的抑菌圈大小分别为12.3mm、14mm、13mm，故红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌对于蛋白浓度为500μg/ml时都是高敏的；而铜绿假单胞菌的抑菌圈大小只有8mm，所以铜绿假单胞菌对于蛋白浓度为500μg/ml时都是低敏的。4、prosp-b重组蛋白最小抑菌浓度(mic)的测定(1)将稀释制备好的菌悬液加入100μl培养在96孔板中，并依次在第1～9中加入50μl各浓度的由实施例1中步骤(7)得到的蛋白液，第10孔作为空白对照，第11、12孔作为阳性对照(细菌为青霉素和头孢克肟，真菌为特比萘芬和酮康唑，浓度均为200μg/ml)。(2)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在生化培养箱37℃恒温培养12h后，将96孔细胞培养板取出，用酶标仪分布在600nm波长处测定od值，计算蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度。(3)石膏样小孢子菌、红色毛癣菌、白色念珠菌在生化培养箱30℃恒温培养4天后，将96孔细胞培养板取出，用酶标仪分布在600nm波长处测定od值，计算蛋白对红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌的最小抑菌浓度。结果如表5所示。表5菌名最小抑菌浓度(mic)μg/ml金黄色葡萄球菌20大肠杆菌30白色念珠菌60红色毛癣菌30石膏样小孢子菌30铜绿假单胞菌125耐甲氧西林金黄色葡萄球菌20由表5可知，prosp-b重组蛋白对细菌类如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均具有较高的抑菌效果，抑制他们生长的prosp-b重组蛋白浓度较低，各只需20μg/ml、30μg/ml、20μg/ml；并且prosp-b重组蛋白对真菌也表现出明显的抑菌作用，如白色念珠菌、石膏样小孢子菌、红色毛癣菌的最小抑菌浓度各为60μg/ml、30μg/ml、30μg/ml，也相对很低，说明只需要较低浓度的prosp-b重组蛋白即可抑制各种细菌、真菌的生长，从而说明了prosp-b重组蛋白具有很高的杀菌、抑菌活性；但prosp-b重组蛋白对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为125μg/ml，相对与另外六种菌是较高的。本实验进而证明prosp-b重组蛋白对常见的g+、g-菌及酵母菌等真菌具有较强的抑制效果。5、pi测定prosp-b重组蛋白对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响(1)在96孔板1～7列中依次加入稀释制备好的金黄色葡萄球菌悬液100μl培养，共4行。在第8列加入100μl的灭菌蒸馏水，然后依次在第1～4列中加入不同量的由实施例1中步骤(7)得到的prosp-b重组蛋白液，使其蛋白终浓度依次为20μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml，第5～8列依次加入青霉素、tritonx-100、灭菌蒸馏水、prosp-b重组蛋白液，使其青霉素终浓度为50μg/ml，tritonx-100的终浓度为0.1％，prosp-b重组蛋白的终浓度为120μg/ml，最后加入一定量的lb培养基，保证每孔体积为200μl。(2)将96孔板放在生化培养箱中37℃培养12h，然后取出，加入pi，使其终浓度为50μg/ml。(3)加入pi后孵育30min，在多功能酶标仪上测定荧光od值，其激发波长为488nm，发射波长为630nm。(4)以tritonx-100的结果为100％计算分析细菌细胞膜的透过率。结果如表6所示。表6由表6可知，较阴性对照和空白对照，实验组的荧光od值明显较高，其细胞的通透性均较强；相对于阳性对照，20μg/ml的prosp-b重组蛋白对细菌细胞膜的通透能达到12.68％，进而破坏细胞内环境的破坏，从而影响其生长，所以prosp-b重组蛋白能通过改变细胞膜的通透性来影响细菌的生长情况。6、细胞膜外渗性实验(1)将制备好的金黄色葡萄球菌菌悬液100μl依次加入到96孔板中，并在1～4中依次加入一定量的由实施例1中步骤(7)得到的prosp-b重组蛋白液，使其终浓度分别为20μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml，在5～8中依次加入青霉素、tritonx-100、灭菌蒸馏水、prosp-b重组蛋白液，其中第8孔不加金黄色葡萄球菌，使其青霉素终浓度为50μg/ml，tritonx-100的终浓度为0.1％，prosp-b重组蛋白的终浓度为120μg/ml，最后加入一定量的lb培养基，保证每孔体积为200μl。(2)将96孔板放在生化培养箱中37℃培养12h，然后取出，按照ldh试剂盒说明书依次加入各试剂，室温孵育5min。(3)然后取出，在多功能酶标仪上测定其在450nm处的od值。(4)以tritonx-100的结果为100％计算分析ldh的释放率。结果如表7所示。表7由表7可知，在正常的细胞下，细胞内环境是稳定的，其胞内外物质保持相对的稳定，而在细胞膜受损伤的情况下，其细胞通过率明显增加，胞内大分子物质会通过受损的细胞膜释放出来，通过检测细菌培养液可以间接说明细胞膜的通透性是否发生明显改变。乳酸脱氢酶(ldh)是胞内的其中一种大分子物质，其检测比较简单，且他的外渗能直接反应出细胞内环境的改变，从而反应出细胞的生理状态变化。由测定的结果可以看出，与阴性对照、空白对照相比，prosp-b重组蛋白处理作用后的金黄色葡萄球菌，其ldh外渗明显增加，说明菌体的细胞膜通透性发生了增加；而与阳性对照相比，120μg/ml的prosp-b重组蛋白就能使细胞的ldh外渗率达到31％，进而影响细菌细胞的稳定，影响其生长，说明prosp-b重组蛋白能发挥改变细菌生理状态的作用。总的来说，由以上实施例1-3的结果可以看出，本发明采用基因工程方法，特别是通过使用特定的表达载体(pgex4t-1)和表达宿主菌(大肠杆菌bl21(de3)plyss菌株)，成功地获得了浓度较高的prosp-b重组蛋白，并且，通过将pgex4t-1载体上的gst标签与prosp-b融合，由于gst标签具有亲水性，可以明显提高prosp-b重组蛋白的水溶性，扩大其应用范围。另外，本发明提供的prosp-b重组蛋白表现出良好的广谱抗菌活性，其对临床上常见的细菌、真菌均具有较强的抑制作用，特别是对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌、红色毛癣菌、铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表现出明显的抑制活性。进一步的研究发现，prosp-b重组蛋白发挥其抗菌作用的可能是通过影响细菌细胞膜的通透性，从而抑制细菌的正常生长。同时，本发明提供的prosp-b重组蛋白的细胞毒性较小，即使将蛋白浓度提高到1mg/ml(该浓度远远大于其对细菌的mic值)，细胞的增殖能力依然高于59％，这说明本发明提供的prosp-b重组蛋白具有较高的安全性。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。sequencelisting<110>重庆理工大学<120>肺表面活性蛋白b前肽的重组蛋白及其制备方法和应用<130><160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>81<212>prt<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>1alaglyalaasnaspleucysglnglucysgluaspilevalhisleu151015leuthrlysmetthrlysgluaspalapheglnaspthrilearglys202530pheleugluglnglucysaspileleuproleulysleuleuvalpro354045argcysargglnvalleuaspvaltyrleuproleuvalileasptyr505560pheglnglyglnilelysprolysalailecysserhisvalglyleu65707580cys<210>2<211>243<212>dna<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>2gcaggagctaatgacctgtgccaagagtgtgaggatattgtccacctcctcacaaagatg60accaaggaagacgctttccaggacacgatccggaagttcctggaacaagaatgtgatatc120ctacccttgaagctgcttgtgccccggtgtcgccaagtgcttgatgtctacctgcccctg180gttatcgactacttccagggccagattaaacccaaagccatctgcagtcatgtgggcctg240tgc243<210>3<211>27<212>dna<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>3aaaggatccgcaggagctaatgacctg27<210>4<211>27<212>dna<213>artificialsequence<220><223>thesequenceissynthesized<400>4tttaagcttttagcacaggcccacatg27当前第1页12