三维肺微组织模型的构建方法及应用与流程

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种三维肺微组织模型的构建方法及应用。

背景技术：

自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是十分重要的生物学现象，参与生物的发育、生长等多种过程。细胞自噬的异常会导致癌细胞的出现。而一些外源物质，如纳米粒、环境污染物、药物等会引发人体内不同程度的细胞自噬。

目前对外源物质引发细胞自噬的检测均是基于二维单一细胞的检测，但是体外二维细胞由于细胞极化，缺乏细胞-细胞和细胞基质间的相互作用，其评价结果往往不能外推关联到体内，在组织层面上仍无法实现细胞自噬的体外研究。因此亟需寻找一个体外类组织模型，在三维状态下，快速有效观察待测物引发的自噬效应。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种三维肺微组织模型的构建方法及应用，采用本发明的方法所构建的三维模型，可直观检测外界物质引发的自噬效应情况。

本发明提供了一种三维肺微组织模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)使用荧光蛋白分别标记lc-3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞，然后均匀共混于聚阴离子聚电解质的水溶液中，得到细胞共混液；

(2)利用静电液滴法将步骤(1)得到的细胞共混液滴入含二价金属离子的凝胶浴中，形成载细胞凝胶微球；

(3)将步骤(2)得到的载细胞凝胶微球培养14-28天，得到三维肺微组织模型。

进一步地，在步骤(1)中，lc-3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞在荧光蛋白标记后，肺巨噬细胞与肺上皮细胞为不同颜色。用两种颜色可区分肺巨噬细胞和肺上皮细胞。lc-3为自噬相关标志物。

进一步地，在步骤(1)中，使用绿色荧光蛋白标记lc-3的肺巨噬细胞，使用红色荧光蛋白标记lc-3的肺上皮细胞。

进一步地，绿色荧光蛋白为gfp、egfp或sfgfp蛋白；红色荧光蛋白为rfp、mrfp或mcherry蛋白。

进一步地，在步骤(1)中，肺巨噬细胞为thp-1、raw264.7或u937细胞，肺上皮细胞为beas-2b、a549、nci-h441或tc-1细胞。

进一步地，在步骤(1)中，肺巨噬细胞与肺上皮细胞的个数比为1:2-2:1。

进一步地，在步骤(1)中，细胞共混液中的细胞密度为2×10⁵-1×10⁷cells/ml。

进一步地，在步骤(1)中，聚阴离子聚电解质为海藻酸钠、透明质酸、琼脂、明胶和果胶中的一种或几种。

进一步地，在步骤(1)中，聚阴离子聚电解质的水溶液的浓度为1％w/v-1.5％w/v。

进一步地，在步骤(2)中，含二价金属离子的凝胶浴为含二价金属离子的氯化钠溶液，金属离子为钙离子、钡离子、镁离子和铁离子中的一种或几种。

在步骤(2)中，细胞共混液滴入凝胶浴后，二价金属离子能够螯合聚电解质中的阴离子，整个反应体系从溶液态转变为凝胶态，因而形成了载细胞凝胶微球，使用该方法，所形成的载细胞凝胶微球大小均一、粒径均匀、球形度高、形貌控制好。

在步骤(3)中，三维肺微组织模型为荧光蛋白标记的肺巨噬细胞与肺上皮细胞的三维细胞聚集体结构。

本发明还提供了一种采用上述方法所构建的三维肺微组织模型作为体外检测和评价肺自噬效应模型的应用。

进一步地，三维肺微组织模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)使用荧光蛋白分别标记lc-3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞，然后均匀共混于聚阴离子聚电解质的水溶液中，得到细胞共混液；

(2)利用静电液滴法将步骤(1)得到的细胞共混液滴入含二价金属离子的凝胶浴中，形成载细胞凝胶微球；

(3)将步骤(2)得到的载细胞凝胶微球培养14-28天，得到三维肺微组织模型。

进一步地，应用时将待测物加入三维肺微组织模型中，定性或定量检测lc-3ii在肺巨噬细胞与肺上皮细胞中的表达，以判定待测物引发的肺自噬效应类型。

进一步地，上述待测物为各种人体外源物质，如具有不同化学组成和理化性质的纳米粒、药物、环境污染物等。

进一步地，由于分别使用不同颜色的荧光标记了标记肺巨噬细胞与肺上皮细胞，因此在激光共聚焦显微镜下可观察到不同颜色荧光斑的分布和数目，对其进行定性或定量分析，判断待测物引发的是肺上皮细胞还是肺巨噬细胞的自噬流异常，并以此判定待测物引发的肺自噬效应类型。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明采用较简单的方法在体外构建多细胞共培养的三维肺微组织模型，其性质比二维模型更接近体内。

2、本发明构建的三维微组织模型中，使用不同荧光标记lc-3的肺细胞，可直观检测待测物的自噬效应，以及各种肺细胞中的分布情况。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明载细胞凝胶微球的光镜照片；

图2图示了实施例2中外源物质引发的三维肺微组织模型的自噬异常情况；

图3是本发明涉及纳米粒引发细胞自噬异常的原理图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

配置浓度为1.5％w/v的无菌海藻酸钠水溶液，将绿色荧光蛋白标记lc-3的肺巨噬细胞thp-1和红色荧光蛋白标记lc-3肺上皮细胞a549离心后，以1:1的细胞比例均匀共混于海藻酸钠水溶液中，得到细胞共混液，其中细胞密度为2×10⁶cells/ml。

利用静电液滴法将细胞共混液滴入含ca²⁺的凝胶浴中(凝胶浴为氯化钠的水溶液)，形成大小均一、粒径均匀的载细胞凝胶微球。静电液滴法的具体操作步骤参见文献“investigationofsphericalhydrogelsurfacewithopticalinterferometer,colloidsandsurfacesa:physicochemicalandengineeringaspects,484(2015)：457-462”中的方法。

对载细胞微球进行表征，测试结果如图1所示，从图中可以看出，本发明的载细胞凝胶微球的粒径均一，且细胞均匀分布在凝胶颗粒中。

随后在10％血清的dmem培养基中，将载细胞微球进行共培养，培养时间为28天，载细胞微球内的两种细胞形成三维细胞聚集体结构，即三维肺微组织模型。

将25μg/ml氯喹加入三维肺微组织模型中，在激光共聚焦显微镜下观察红色荧光斑和绿色荧光斑的分布和数目。然后定性和定量分析红色荧光斑和绿色荧光斑，判断氯喹引发三维肺微组织中thp-1和a549细胞的自噬流异常情况。结果表明，使用氯喹处理三维肺微组织模型后，可引发较强的红色荧光斑和绿色荧光斑，因此在氯喹作用下，肺上皮细胞a549和肺巨噬细胞thp-1均会产生强烈的自噬异常。

实施例2

配置浓度为1.5％w/v的无菌海藻酸钠水溶液，将绿色荧光蛋白标记lc-3的thp-1和红色荧光蛋白标记lc-3的beas-2b离心后，以1:1的细胞比例均匀共混于海藻酸钠水溶液中，得到细胞共混液，其中细胞密度为2×10⁶cells/ml。

利用静电液滴法将细胞共混液滴入含ca²⁺的凝胶浴中(凝胶浴为氯化钠的水溶液)，形成大小均一、粒径均匀的载细胞凝胶微球。具体操作步骤与实施例1相同。

参照实施例1的方法，将载细胞微球进行共培养，培养时间为28天，载细胞微球内的两种细胞形成三维细胞聚集体结构，即三维肺微组织模型。

将50μg/mlla2o3纳米粒加入三维肺微组织模型中，在激光共聚焦显微镜下观察红色荧光斑和绿色荧光斑的分布和数目。然后定性和定量分析红色荧光斑和绿色荧光斑，判断la2o3纳米粒引发三维肺微组织中thp-1和a549细胞的自噬流异常情况。结果如图2所示，图2(a)为绿色荧光斑，即引发肺巨噬细胞的自噬异常；图2(b)为红色荧光斑，即引发肺上皮细胞的自噬异常，对比图2(a)(b)可发现，使用la2o3纳米粒处理三维肺微组织模型后，引发的绿色荧光斑显著多于红色荧光斑，因此在la2o3纳米粒作用下，肺巨噬细胞thp-1会产生更强的自噬流异常。

实施例3

配置浓度为1％w/v的无菌海藻酸钠水溶液，将绿色荧光蛋白标记lc-3的u937和红色荧光蛋白标记lc-3肺上皮细胞beas-2b离心后，以1:2的细胞比例均匀共混于海藻酸钠水溶液中，得到细胞共混液，其中细胞密度为5×10⁶cells/ml。

利用静电液滴法将细胞共混液滴入含ba²⁺的凝胶浴中(凝胶浴为氯化钠的水溶液)，形成大小均一、粒径均匀的载细胞凝胶微球。具体操作步骤与实施例1相同。

参照实施例1的方法，将载细胞微球进行共培养，培养时间为14天，载细胞微球内的两种细胞形成三维细胞聚集体结构，即三维肺微组织模型。

将50μg/ml石墨烯纳米粒加入三维肺微组织模型中，在激光共聚焦显微镜下观察红色荧光斑和绿色荧光斑的分布和数目。然后定性和定量分析红色荧光斑和绿色荧光斑，判断石墨烯纳米粒引发三维肺微组织中细胞的自噬流异常情况。

图3是本发明依据的原理图，外源毒性物质(如纳米粒)通过胞吞进入细胞，会导致溶酶体损伤，从而阻断了自噬流通路，自噬体在细胞中大量积累，导致细胞自噬流异常。具体原理与文献“interferenceinautophagosomefusionbyrareearthnanoparticlesdisruptsautophagicfluxandregulationofaninterleukin-1βproducinginflammasome,acsnano,8(2014)：10280-10292”中的相同。本发明依据该原理建立三维肺微组织，首次在三维体系下评价待测物质的细胞自噬效应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。