OsNPF5.16基因在提高水稻单株产量中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及osnpf5.16基因在提高水稻单株产量中的应用。

背景技术：

植物通过吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等来获得氮素；氮的吸收和转运主要依靠铵根运输蛋白（amt）、硝酸根运输蛋白（nrt）、氨基酸运输蛋白（aat）、肽运输蛋白（ptr）等运输蛋白来完成（williamsl,millera.transportersresponsiblefortheuptakeandpartitioningofnitrogenoussolutes.annualreviewofplantphysiologyandplantmolecularbiology,2001,52:659-688.）。铵通过植物amt吸收后再通过谷氨酰胺合成酶（gs）和谷氨酸合酶（gogat）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再进一步形成其它氨基酸（sonoday,ikedaa,saikis,etal.feedbackregulationoftheammoniumtransportergenefamilyamt1byglutamineinrice.plantcellphysiology,2003,44:1396-1402.）。植物可通过高亲和转运系统（hats）的nrt2和低亲和转运系统（lats）的nrt1吸收环境中的硝酸盐，由硝酸还原酶（nr）和亚硝酸还原酶（nir）还原形成铵，再进一步形成氨基酸（paungfoo-lonhiennec,lonhiennetg,rentschd,etal.plantscanuseproteinasanitrogensourcewithoutassistancefromotherorganisms.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2008,105:4524-4529.）。

氮运输npf家族包括nrt1和ptr亚家族，不同成员在植株不同部位运输硝酸根、寡肽或氨基酸等，在植株生长发育上起不同的作用（rentschd,schmidts,tegederm.transportersforuptakeandallocationoforganicnitrogencompoundsinplants.febsletters,2007,581:2281-2289.）。osnpf2.2介导了木质部硝酸根的卸载，影响水稻植株生长（liy,ouyangj,wangyy,etal.disruptionofthericenitratetransporterosnpf2.2hindersroot-to-shootnitratetransportandvasculardevelopment.scientificreports,2015,5:9635.）。osnpf7.2对硝酸根有低亲和运输，能够影响植株生长（hur,qiud,cheny,etal.knock-downofatonoplastlocalizedlow-affinitynitratetransporterosnpf7.2affectsricegrowthunderhighnitratesupply.frontiersinplantscience,2016,7.）。

虽然已知氮营养可以促进植物生长发育，但是氮营养影响了植株什么类型的生长发育目前还没有系统的了解。另外水稻npf家族有80多个成员，氮营养是通过npf基因家族什么成员进行响应，在什么部位介导了氮营养运输，从而影响了植株什么类型的生长发育，目前也几乎未知。所以，挖掘出npf家族中可能具有氮高效运输基因，特别是能够控制水稻农艺性状的氮运输关键基因，将有利于水稻高产品种的培育。本发明通过长期研究后发现，npf家族osnpf5.16基因对水稻的单株产量有重要的调控作用，该基因通过超表达后能使水稻增产，可直接应用于植物株型改良。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供水稻npf基因家族成员osnpf5.16基因在提高水稻单株产量中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻的npf基因家族成员osnpf5.16基因为对象，从水稻中花11中克隆了osnpf5.16的cdna序列。通过构建osnpf5.16基因超表达载体，采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到osnpf5.16基因超表达植株，其分蘖数、穗数和灌浆粒数与对照野生型中花11相比显著提高。通过rnai技术构建osnpf5.16基因干扰表达载体，将干扰表达载体导入中花11中，得到osnpf5.16基因表达量下降的干扰植株，干扰植株的分蘖数、穗数和灌浆粒数与中花11相比显著降低。这些结果表明，通过提高osnpf5.16基因的表达，可以使正常的水稻分蘖数、穗数和灌浆粒数增加，从而提高水稻单株产量。

基于本发明发现的osnpf5.16基因的功能，osnpf5.16基因可用于水稻选育中。所述的水稻选育为提高水稻分蘖数、穗数和灌浆粒数，从而提高水稻单株产量。具体可通过提高osnpf5.16基因的表达使水稻分蘖数、每株穗数、每株灌浆粒数增加，达到提高水稻单株产量的目的。

osnpf5.16基因也可用于提高其他植物的产量，如通过转基因使osnpf5.16基因在植物中（超量）表达，来提高植物的分枝数量，进而使植物的产量得到提高。所述的植物是指单子叶植物或双子叶植物；如：小麦、番茄、草坪草或苜蓿等。

所述的osnpf5.16基因编码的osnpf5.16蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述的osnpf5.16基因的cdna序列优选如seqidno.2所示。

应该理解为，在不影响osnpf5.16蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对seqidno.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，osnpf5.16蛋白还包括seqidno.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的优点和效果：

（1）本发明克隆的osnpf5.16基因超表达后使水稻分蘖数、穗数和灌浆粒数增加，说明osnpf5.16基因对提高水稻产量有明显影响，因此，通过基因工程技术提高osnpf5.16基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过正常施氮条件下培育高产水稻，还可以通过分子育种进行植物的品种改良。

（2）osnpf5.16基因的成功克隆，进一步证实了npf家族在氮吸收过程中的重要作用，对阐明npf家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。

（3）尽管目前已克隆到了一些提高植物产量的基因，但对植物增产的分子机制仍不清楚。而本发明克隆的osnpf5.16基因能够提高水稻的产量，对确定植物增产的关键因素有极大的推动作用。

附图说明

图1是对照中花11、osnpf5.16基因超表达植株2个株系和osnpf5.16基因干扰植株2个株系的整株表型图。

图2是对照中花11、osnpf5.16基因超表达植株2个株系和osnpf5.16基因干扰植株2个株系每株分蘖数的统计柱状图，数据采用spss软件进行变量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别小写字母（a、b、c）表示差异显著。

图3是对照中花11、osnpf5.16基因超表达植株2个株系和osnpf5.16基因干扰植株2个株系每株有效穗数的统计柱状图，数据采用spss软件进行变量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别小写字母（a、b、c）表示差异显著。

图4是对照中花11、osnpf5.16基因超表达植株2个株系和osnpf5.16基因干扰植株2个株系的每株灌浆粒数表型图。

图5是对照中花11、osnpf5.16基因超表达植株2个株系和osnpf5.16基因干扰植株2个株系的每株灌浆粒数统计图，数据采用spss软件进行变量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别小写字母（a、b、c）表示差异显著。

图6是对照中花11、osnpf5.16基因超表达植株2个株系和osnpf5.16基因干扰植株2个株系中osnpf5.16基因相对表达量的统计柱状图，数据采用spss软件进行变量分析（anova），使用duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别小写字母（a、b、c）表示差异显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术（参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1osnpf5.16基因超表达植株的构建

提取水稻中花11的rna，并将其反转录成cdna，利用引物对：

f1：5'-ggtaccatggacgcgggggcggagcccctc-3'（kpni），

r1：5'-tctagaatccaattccaatcctttgcaacg-3'（xbai）；

通过pcr扩增osnpf5.16基因的cdna后，通过kpni、xbai酶切后连入pcambia-1306载体（pcambia-1306载体购自cambia公司），构建出osnpf5.16基因的超表达载体osnpf5.16-p1306。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常水稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组dna通过pcr对转基因植株进行检测，检测引物对为：

f2：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r2：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至t2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到osnpf5.16基因超表达植株。osnpf5.16基因超表达植株的分蘖数、有效穗数和灌浆粒数远多于对照中花11植株，差异显著，如图1-5所示。

取osnpf5.16基因超表达植株叶片，提取rna并将其反转录成cdna，通过实时荧光定量pcr检测osnpf5.16基因的表达量，结果显示（图6）超表达植株osnpf5.16基因的表达量与对照中花11相比显著升高。实时荧光定量pcr所用引物对为：

f3：5'-cggcatctccgggaacctga-3'，

r3：5'-gcgcagatgatgatgcggta-3'。

实施例2osnpf5.16基因干扰植株的构建

提取水稻中花11的rna，并将其反转录成cdna，利用引物对：

f4：5'-ggtaccggagatctcggagcggttcgcctt-3'（kpni），

r4：5'-ggatcccatgccaagccccaggatgt-3'（bamhi）；

f5：5'-actagtggagatctcggagcggttcgcctt-3'（spei），

r5：5'-gagctccatgccaagccccaggatgt-3'（saci）；

各自pcr扩增出osnpf5.16基因的cdna片段后，通过相应的限制性内切酶酶切后连入ptck303载体，构建出osnpf5.16基因的干扰表达载体osnpf5.16-ptck303。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入正常粳稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组dna通过pcr对转基因植株进行检测，检测引物对为：

f2：5'-gatgttggcgacctcgtatt-3'，

r2：5'-tcgttatgtttatcggcacttt-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至t2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到osnpf5.16基因干扰植株。osnpf5.16基因干扰植株的每株分蘖数、有效穗数和灌浆粒数远少于对照中花11植株，差异显著，如图1-5所示。

取osnpf5.16基因干扰植株叶片，提取rna并将其反转录成cdna，通过实时荧光定量pcr检测osnpf5.16基因的表达量，结果显示（图6）干扰植株osnpf5.16基因的表达量与对照中花11相比显著降低。实时荧光定量pcr所用引物同实施例1。

上述结果表明，通过提高osnpf5.16基因的表达，可以增加水稻的分蘖数、穗数，并使得水稻每株灌浆粒数增加，进而提高水稻产量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>武汉生物工程学院

<120>osnpf5.16基因在提高水稻单株产量中的应用

<130>1

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>361

<212>prt

<213>oryzasativa

<400>1

metaspalaglyalagluproleuleuproproproalaseralaval

151015

asphisleuglyargproalaserargargthrserglyargtrpleu

202530

alaalaleupheileileglyvalgluilesergluargphealaphe

354045

glyglyileserglyasnleuilethrtyrleuthrglyproleugly

505560

glnserthralaseralaalaalaalaileasnalatrpasnglyala

65707580

alaleuleuleuproleuleuglyalaalavalalaaspsertrpleu

859095

glyargtyrargileileilecysalaserleuleutyrileleugly

100105110

leuglymetleuthrleuserprovalleuvalprohisglnglnala

115120125

gluserglyaspasnalaaspasnasnalasersersermetaspile

130135140

hisvalalaphephetyrleuserleutyrilevalalaphealagln

145150155160

glyglyhislysprocysvalglnalapheglyalaaspglnpheasp

165170175

gluasnaspprogluglucysalaserargserserphepheasntrp

180185190

trptyrpheglyiletyrglyglyasnvalilethrvalserileleu

195200205

asntyrileglnaspasnileglytrpglnleuglypheglyilepro

210215220

cysilealametserleuserleualavalpheleuleuglythrlys

225230235240

sertyrargphetyrproleuargserasnthrserleupheaspgln

245250255

valglylysserleuleualalysileargtrptrpcysalasertrp

260265270

cysserlysserserglyaspleuhiscysthrglnalaserserser

275280285

glnglyasphisasnaspalaglulysalacyspheproaspgluala

290295300

thralavalleulysleupheproileglyalathrcysleuiletyr

305310315320

alailevalphealaglntrpilethrleuphethrlysglnalaser

325330335

thrleuaspargtrpileglyglythrglnargthrleualavalser

340345350

glnargcyslysglyleugluleuasp

355360

<210>2

<211>1086

<212>dna

<213>oryzasativa

<400>2

atggacgcgggggcggagcccctcctgccgccgccggcttccgcggtggaccacctcggc60

cgtccggcctcccgccgcacctccggccggtggctcgccgccctcttcatcatcggcgtg120

gagatctcggagcggttcgccttcggcggcatctccgggaacctgatcacctacctgacc180

ggcccgctggggcagtccacggcgtccgccgccgccgccatcaacgcgtggaacggagct240

gcgctgctgctcccgctgctcggcgccgccgtcgccgactcctggctcggccgctaccgc300

atcatcatctgcgcctccctcctctacatcctggggcttggcatgctcacgctatcaccg360

gttcttgtacctcatcaacaagcagaatctggagataatgcagataataatgcatcctcc420

agtatggacattcatgtagctttcttctacttgtccctgtatatcgtggcctttgctcaa480

ggtggccacaaaccttgtgtccaagcatttggggccgaccaatttgatgagaatgaccct540

gaagaatgtgcctcaaggagctcatttttcaattggtggtactttgggatatatggcggc600

aatgtcattacagtttcaatcttgaattacattcaagataacataggctggcagcttggg660

tttggaatcccttgcattgccatgtctctttctcttgcagtattcttgcttgggaccaag720

agttaccgcttctatcctctaagaagtaacacaagcctattcgaccaggttgggaaatcg780

cttctagcaaagatacgatggtggtgcgcatcatggtgttcaaaatcatcaggggatctt840

cactgcacccaagcatcatcatcccagggagatcacaatgatgcagaaaaggcatgcttt900

cctgatgaagccaccgctgtgcttaaattgttcccaataggggcaacctgcctgatttac960

gcaattgtttttgcccagtggataacactgttcactaagcaagcaagcacactagacagg1020

tggataggaggtactcaaagaaccctcgcggtatcacaacgttgcaaaggattggaattg1080

gattga1086