一种植物乳杆菌高产胞外多糖的方法与流程

本发明属于乳酸菌胞外多糖领域，具体涉及一种植物乳杆菌高产胞外多糖的方法。
背景技术：
：细菌胞外多糖(exopolysaccharides，eps)是一类微生物利用培养基中的碳源经过一系列磷酸化、脂质化、连接、聚合及运输到胞外即可附着在细胞壁上亦可直接渗入到培养中，由寡糖经脂质载体聚合而成的大分子多糖，其中由一种寡糖形成的多糖为同型多糖，否则为异型多糖，经过提取纯化并冻干后的多糖呈白色。胞外多糖的生理生化功能主要体现在食品加工中，比如可以作为稳定的增稠剂、乳化剂、脱水收缩剂，相对化学添加剂而言，胞外多糖的天然无毒性将更有市场价值。不同的乳酸菌所产生的eps结构不同，即寡糖组成和比例不同，同时，同种菌株在不同的碳源存在条件下也将生成不同结构的eps。因此可选择合适的碳源、发酵条件、菌株等来获得高产eps菌株。此外，胞外多糖在聚合运输到胞外后，可作为物理保护屏障起到保护菌体免受外界毒害、抵御外界不良信息的作用，还可协助细胞与细胞间的识别、便于在特殊环境中附着在固体表面，比如在营养相对较缺乏的环境中，固定在营养较丰富的表面上，待营养物耗尽便从表面解离。eps作为次级代谢物可保护细菌免受干燥、捕食，并具有一定耐毒性。细菌eps的大量分泌使得液体培养基变粘稠，可作为良好的增稠剂、乳化剂。除此之外，乳酸菌eps对人体的免疫系统也有一定调节作用，如增强巨噬细胞的活性，这为食品工业、化学工业和医药行业带来研究价值。膳食纤维的摄入可以降低代谢综合征的生理危险因素，例如高血脂和低度炎症状态。膳食纤维通常是来源于植物，然而微生物胞外多糖(eps)具有可潜在地发挥类似生理效应的结构。多项实验表明eps可抑制血压升高，降低血清胆固醇总水平，降低动物体内血糖水平，并能够在动物肠粘膜中诱导免疫应答反应调节免疫能力，这表明可以使用微生物eps来控制代谢综合征中发生的异常，并且eps的研究可为降脂药物或保健品的开发提供理论指导。然而目前微生物胞外多糖的产量依然较低，想要投入大规模的生产还需要进一步的提高菌种生产能力，并且eps结构和特性随菌株和发酵条件的改变而不同，比如碳源、发酵时间和培养基组成的差异，eps产量和性能也将有所不同。进一步提高微生物eps产量，并开拓其生理生化特性，将是胞外多糖研究领域的突破点。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌高产胞外多糖的方法。目前在乳酸菌产eps的研究领域中主要集中在eps的提取纯化及其结构鉴定方面，本发明提供一种经过优化实验后的植物乳杆菌高产胞外多糖的发酵条件，以及所提取的eps具有高效降胆固醇的功能，开拓了eps降低胆固醇的潜力。利用本发明中的植物乳杆菌高产胞外多糖的发酵条件后，eps具有很明显的降胆固醇能力的提升。本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的植物乳杆菌胞外多糖。本发明的再一目的在于提供上述植物乳杆菌胞外多糖的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种植物乳杆菌高产胞外多糖的方法，包括如下步骤：(1)植物乳杆菌la-10(lactobacillusplantarum，以下简称la-10)在改良mrs液体培养基中静置发酵，其接种量为3％～5％(v/v)，得菌体发酵液；所述的静置发酵的条件为25℃～31℃静置发酵30h～40h；所述的改良mrs液体培养基：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖30～40g/l、k2hpo4为2.0g/l、乙酸钠5.0g/l、柠檬酸三铵2.0g/l、mgso4·7h2o为0.58g/l、mnso4·4h2o为0.25g/l、吐温-80为1.0ml/l，ph6.2～6.4，灭菌，备用；(2)将步骤(1)得到的菌体发酵液离心，取上清液；加入三氯乙酸(tca)除蛋白，4℃条件下静置，离心取上清液；95％乙醇沉淀多糖，离心弃上清液，沉淀透析后得到粗多糖，测定提取量并冻干成粉末状，即植物乳杆菌胞外多糖。步骤(1)中所述的接种量优选为4～5％；最优选为4％；步骤(1)中所述的静置发酵的条件优选为30～31℃静置发酵30～35h；最优选为30℃静置发酵30h。步骤(1)中所述的改良mrs液体培养基优选为：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖30～34g/l、k2hpo4为2.0g/l、乙酸钠5.0g/l、柠檬酸三铵2.0g/l、mgso4·7h2o为0.58g/l、mnso4·4h2o为0.25g/l、吐温-80为1.0ml/l，ph6.2～6.4，灭菌，备用；最优选的，步骤(1)中所述的改良mrs液体培养基为：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖30g/l、k2hpo4为2.0g/l、乙酸钠5.0g/l、柠檬酸三铵2.0g/l、mgso4·7h2o为0.58g/l、mnso4·4h2o为0.25g/l、吐温-80为1.0ml/l，ph6.2～6.4，灭菌，备用；所述的灭菌优选为121℃灭菌30分钟。步骤(2)中所述的离心的条件均优选为4℃、8000r/min离心15min。步骤(2)中所述的透析所用的透析袋的孔径大小为3500da。步骤(2)中所述的测定提取量为2.67～3.18g/l。一种植物乳杆菌胞外多糖，通过上述制备方法制备得到。所述的植物乳杆菌胞外多糖在制备降脂药物或保健品中的应用。将植物乳杆菌胞外多糖加入至1g/l的胆固醇标准液中，其中，植物乳杆菌胞外多糖的终浓度为0.8～1.6g/l，于恒温条件下30～37℃振荡吸附15～25h，实现胆固醇的高效吸附。优选的，所述的植物乳杆菌胞外多糖的终浓度为0.8g/l。优选的，所述的振荡吸附的条件为于恒温条件下30℃振荡吸附15h。本发明所使用的菌株是广东省微生态制剂工程技术研究中心筛选得到的具有一定降胆固醇能力的植物乳杆菌la-10(lactobacillusplantarum，以下简称la-10)，目前保存于华南农业大学微生态制剂工程技术研究中心。菌株la-10在改良mrs液体培养基中静置发酵，在接种量分别为2％、3％、4％、5％、6％时，接种量为4％的菌体发酵液经过提取纯化并使用苯酚-硫酸法检测的eps提取量最高(图1)。菌株la-10分别在蔗糖含量为5g/l、10g/l、20g/l、30g/l、40g/l的改良mrs液体培养基中静置发酵，当培养基中的蔗糖含量为30g/l时的菌体发酵液经过提取纯化并使用苯酚-硫酸法检测的eps提取量最高(图2)。菌株la-10在改良mrs液体培养基中静置发酵，其发酵温度分别为20℃、25℃、30℃、37℃、42℃，当发酵温度为30℃时，菌体发酵液经过提取纯化并使用苯酚-硫酸法检测的eps提取量最高(图3)。菌株la-10在改良mrs液体培养基中分别静置发酵15h、25h、30h、35h、40h，其中30h的菌体发酵液经过提取纯化并使用苯酚-硫酸法检测的eps提取量最高(图4)。上述菌株胞外多糖发酵的改良mrs液体培养基组成为：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖30g/l、k2hpo42.0g/l、乙酸钠5.0g/l、柠檬酸三铵2.0g/l、mgso4·7h2o0.58g/l、mnso4·4h2o0.25g/l、吐温-801.0ml/l，ph6.2～6.4，121℃灭菌30分钟后使用。上述植物乳杆菌eps提取方法：菌体发酵液经4℃、8000r/min离心15min，取上清液并弃去菌体沉淀；上清液加入三氯乙酸(tca)至终质量分数为4％，4℃条件下静置过夜，以去除蛋白；4℃、8000r/min离心15min取上清液；上清液中加入3倍体积的95％乙醇，于4℃条件下静置过夜，沉淀粗多糖；4℃、8000r/min离心15min，弃上清，将沉淀溶于灭菌的ddh2o中；经三级水透析(透析袋孔径大小为3500da)16h，其间每8h换水一次，再用超纯水透析8h，其间每4h换水一次，收集透析后的多糖溶液，吸取少量稀释数倍，根据葡萄糖标准曲线并利用苯酚-硫酸法测定eps含量；加入3倍体积的95％乙醇沉淀剩余eps，冻干收集多糖粉末。葡萄糖标准曲线绘制：精密量取标准葡萄糖溶液(0.6mg/ml)1ml、2ml、4ml、6ml、10ml，分别置于50ml容量瓶中，加水定容，摇匀；精密量取上述各容量瓶中的溶液2ml，分别加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，用取样器混匀；40℃水浴30min，取出并冷却至室温；分光光度计测定吸光值od490；以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作线性回归方程，葡萄糖标准曲线见图5。上述la-10的eps定量方法(苯酚-硫酸法)：将待测溶液稀释数倍后，并吸取2ml于50ml离心管中，量取3份；分别加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，摇匀；40℃水浴30min，取出并冷却至室温；分光光度计测定吸光值od490；根据标准曲线计算多糖含量。除此之外，本发明中的la-10所产的eps具有高效降胆固醇的功能，经过体外优化实验，可达到40％的胆固醇清除率，优化前和优化后的eps降胆固醇能力差异见图6。上述优化前的原始mrs液体培养基：细菌学蛋白胨10.0g/l，牛肉膏10.0g/l，酵母粉5g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，柠檬酸氢二铵2.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温-801.0ml/l，乙酸钠5.0g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l、ph6.5。la-10分别以最适发酵条件在原始mrs液体培养基中发酵，其发酵液经过提取纯化后得到的eps降胆固醇率为17.12％±2.9％，在改良mrs液体培养基中发酵，其发酵液经过提取纯化后得到的eps降胆固醇率为40.60％±3.2％。la-10在本发明中的最适碳源含量、发酵时间、发酵温度、接种量以及培养基组成的发酵条件下经过提取纯化后的eps不仅产量得到了提高，其降胆固醇性能亦有所提高。分别准确称取从la-10的发酵液中提取得到的胞外多糖粉末(0.1g/l、0.4g/l、0.8g/l、1.2g/l、1.6g/l)置于50ml离心管中，加入10ml胆固醇标准液(1mg/ml)，以不加入胞外多糖为对照。于恒温条件下37℃振荡吸附12h，10000rpm离心6分钟，取上清液，邻苯二甲醛法测上清液胆固醇含量，其最佳eps质量浓度为0.8g/l，胆固醇吸附率高达43.79％±1.36％(图7)。分别准确称取相应适量的从la-10的发酵液中提取得到的胞外多糖粉末置于50ml离心管中，加入10ml胆固醇标准液，以不加入胞外多糖为对照。于恒温条件下37℃振荡吸附一定的时间(5h、10h、15h、20h、25h)，10000rpm离心6分钟，取上清液，邻苯二甲醛法测上清液胆固醇含量，并利用上述公式计算出la-10胞外多糖的胆固醇吸附率，其最佳吸附时间为15h，胆固醇吸附率是43.85％±1.32％(图8)。分别准确称取相应适量的从la-10的发酵液中提取得到的胞外多糖粉末置于50ml离心管中，加入10ml胆固醇标准液，以不加入胞外多糖为对照。于恒温条件下(15℃、25℃、30℃、37℃、42℃)振荡吸附数小时，12000rpm离心2分钟，取上清液，邻苯二甲醛法测上清液胆固醇含量，并利用上述公式计算出la-10胞外多糖的胆固醇吸附率。最佳吸附温度为30℃，其胆固醇清除率为33.78％±0.4％(图9)。胆固醇标准曲线绘制，见图10。表1标准曲线加样体系配置混合体系时，浓硫酸缓慢加入，并用取样器充分混匀，室温静置10min，分光光度计测od550。上述上清液中胆固醇定量方法(领苯二甲醛法)：将待测溶液稀释数倍后，并吸取400μl于15ml离心管中，量取3份；分别加入领苯二甲醛试剂2ml，95％的硫酸溶液1ml，用取样器混合均匀；室温静置10min；分光光度计测定吸光值od550；根据标准曲线计算胆固醇含量，并根据公式计算出胆固醇清除率。除此之外，本发明中的植物乳杆菌la-10胞外多糖降胆固醇功能还体现在：根据上述高产胞外多糖的发酵方法，吸取能提取出10mg胞外多糖的菌体发酵液约3.4ml，热水煮沸15分钟以灭活菌体，离心取已灭活菌体于灭菌离心管中，另取3.4ml浑浊发酵液于灭菌离心管中并热水煮沸15分钟以灭活菌体，再取另一干净离心管中加入10mgeps固体粉末，分别加入10ml含有1％胆固醇溶解液(10mg/ml)的改良mrs液体培养基，30℃静置12h，进行降胆固醇能力比较，分别以不加菌体和加入3.4ml新鲜配置的改良mrs液体培养基为对照，根据标准曲线，计算出胆固醇含量，并参照上述公式分别计算出eps、灭活菌体与菌液的降胆固醇率。上述菌液中胆固醇含量测定方法：10000rpm，6min离心取上清样液0.5ml，加入无水乙醇3.0ml；加入50％koh2.0ml，振荡器混合均匀；60℃水浴15min；冷却后加入正己烷5.0ml，混合均匀，加入一级水3.0ml，混合均匀，室温静置15min；待溶液分层，取正己烷层(最上层)溶液400μl沸水浴蒸干；加入领苯二甲醛溶液2.0ml，95％的硫酸溶液1.0ml，用取样器混合均匀；室温静置10min，分光光度计测定吸光值(od550)；根据标准曲线计算胆固醇含量，比较菌体、eps与菌液的降胆固醇能力。结果表明：eps降胆固醇率高达59％，热灭活的菌体和发酵菌液降胆固醇率分别是6.45％、9.99％(图11)。热灭活的菌体和发酵菌液对培养基中的胆固醇都有一定的清除作用，发酵菌液相比灭活菌体吸附率较高，说明菌液中的化学物质或菌体分泌的代谢产物有降胆固醇能力，比如某些有机酸、胶状胞外多糖等，植物乳杆菌eps分泌到胞外呈粘液状或胶状，其冻干粉末状见图12。本发明不仅提供了一种植物乳杆菌高产胞外多糖的发酵条件和提取纯化方法，还通过实验发现提取获得的eps具有高效的胆固醇清除功能，为现代降脂药物和保健品的开发提供新思路。本发明进一步研究了eps不同状态的降胆固醇功能，为eps开拓不同的市场应用提供指导。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：本发明所使用的菌株具有高效产胞外多糖的特点，并且该菌株在本发明中的发酵条件下所产生的eps具有高效降胆固醇的功能，具体体现在：1)通过单因素优化实验获得菌株最佳产胞外多糖的发酵条件，其产量可高达2.67～3.18g/l；2)通过优化前与优化后的eps降胆固醇能力比较，eps降胆固醇能力得到了明显提升；3)通过单因素体外定性实验，其eps具有高效的胆固醇清除能力，最高可达59％；4)通过实验发现分泌到胞外的未经过提取纯化的eps依然具有一定的胆固醇清除能力。使用本发明中的发酵条件和制备方法可提高微生物eps产量，并且获得的eps有高效降胆固醇能力，具有广阔的降脂药物和保健品的开发应用。附图说明图1是植物乳杆菌la-10高产eps最适接种量测定结果。图2是植物乳杆菌la-10高产eps最适蔗糖含量测定结果。图3是植物乳杆菌la-10高产eps最适发酵温度测定结果。图4是植物乳杆菌la-10高产eps最适发酵时间测定结果。图5是葡萄糖标准曲线。图6是发酵优化前和优化后的eps降胆固醇能力差异。图7是eps降胆固醇最适质量浓度测定结果。图8是eps降胆固醇最适吸附时间测定结果。图9是eps降胆固醇最适吸附温度测定结果。图10是胆固醇标准曲线。图11是菌液、灭活菌体及eps降胆固醇能力比较测定结果。图12是植物乳杆菌la-10提取纯化冻干后的eps固体粉末。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1植物乳杆菌la-10胞外多糖的发酵及提取纯化植物乳杆菌la-10按4％体积分数的接种量接种于改良mrs液体培养基中，30℃的发酵温度，静置培养30小时，其中改良mrs液体培养基中的蔗糖含量为30g/l。表2各单因素的最高提取量单因素eps(g/l)接种量3.1756±0.02b蔗糖含量2.8255±0.03a发酵温度2.9417±0.09a发酵时间2.6694±0.001a改良mrs液体培养基组成：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖30g/l、k2po4为2.0g/l、乙酸钠5.0g/l、柠檬酸三铵2.0g/l、mgso4·7h2o为0.58g/l、mnso4·4h2o为0.25g/l、吐温-80为1.0ml/l，ph6.2～6.4。eps提取方法为：(1)4℃、8000r/min离心15min，取上清液并弃去菌体沉淀。(2)上清液加入三氯乙酸(tca)至终质量分数为4％，4℃条件下静置过夜，以去除蛋白。(3)4℃、8000r/min离心15min取上清液。(4)上清液中加入3倍体积的95％乙醇，于4℃条件下静置过夜，沉淀粗多糖。(5)4℃、8000r/min离心15min，弃上清，将沉淀溶于灭菌的ddh2o中。(6)经三级水透析(透析袋孔径大小为3500da)16h，其间每8h换水一次，再用超纯水透析8h，其间每4h换水一次，收集透析后的多糖溶液，吸取少量稀释数倍，苯酚-硫酸法测定eps含量为2.664g/l。(7)加入3倍体积的95％乙醇溶液，于4℃条件下静置过夜，收集多糖并冻干。葡萄糖标准曲线绘制：精密量取标准葡萄糖溶液(0.6mg/ml)1ml、2ml、4ml、6ml、10ml，分别置于50ml容量瓶中，加水定容，摇匀；精密量取上述各容量瓶中的溶液2ml，分别加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，用取样器混匀；40℃水浴30min，取出并冷却至室温；分光光度计测定吸光值od490；以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作线性回归方程，葡萄糖标准曲线见图5。苯酚-硫酸法：吸取上清液300μl，稀释30倍后，并吸取2ml于50ml离心管中，量取3份；分别加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，摇匀；40℃水浴30min，取出并冷却至室温；分光光度计测定吸光值od490；根据标准曲线计算多糖含量。实施例2植物乳杆菌la-10胞外多糖的降胆固醇定性方法收集接种量为4％、蔗糖含量为30g/l、发酵时间为30h、发酵温度为30℃时，la-10在改良mrs液体培养基中经过静置培养后提取纯化并冻干的eps粉末。称取eps固体粉末0.8g/l于15ml干净离心管中，并加入10ml胆固醇标准液(1mg/ml)，以不加入胞外多糖为对照。于恒温条件下30℃振荡吸附15h，10000rpm离心6分钟，取上清液，邻苯二甲醛法测上清液胆固醇含量，并利用上述公式计算出la-10胞外多糖的胆固醇吸附率为41.45％±1.3％。领苯二甲醛法：吸取500μl上清液，将待测溶液稀释5倍后，并吸取400μl于15ml离心管中，量取3份；分别加入领苯二甲醛试剂2ml，95％的硫酸溶液1ml，用取样器混合均匀；室温静置10min；分光光度计测定吸光值od550；根据胆固醇标准曲线计算胆固醇含量，并根据公式计算出胆固醇清除率。胆固醇标准曲线绘制，见表1和图10。实施例3植物乳杆菌la-10液体静置发酵产eps植物乳杆菌la-10按5％体积分数的接种量接种于改良mrs液体培养基中，31℃的发酵温度，静置培养35小时，其中改良mrs液体培养基中的蔗糖含量为34g/l。mrs液体培养基组成：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖34g/l、k2po4为2.0g/l、乙酸钠5.0g/l、柠檬酸三铵2.0g/l、mgso4·7h2o为0.58g/l、mnso4·4h2o为0.25g/l、吐温-80为1.0ml/l，ph6.2～6.4。eps提取方法为：(1)4℃、8000r/min离心15min，取上清液并弃去菌体沉淀。(2)上清液加入三氯乙酸(tca)至终质量分数为5％，4℃条件下静置过夜，以去除蛋白。(3)4℃、8000r/min离心10min取上清液。(4)上清液中加入4倍体积的95％乙醇，于4℃条件下静置过夜，沉淀粗多糖。(5)4℃、8000r/min离心10min，弃上清，将沉淀溶于灭菌的ddh2o中。(6)经三级水透析(透析袋孔径大小为3500da)16h，其间每8h换水一次，再用超纯水透析8h，其间每4h换水一次，收集透析后的多糖溶液，吸取少量稀释数倍，苯酚-硫酸法测定eps含量为2.955±0.039g/l。(7)加入3倍体积的95％乙醇溶液，于4℃条件下静置过夜，收集多糖并冻干。葡萄糖标准曲线绘制：精密量取标准葡萄糖溶液(0.6mg/ml)1ml、2ml、4ml、6ml、10ml，分别置于50ml容量瓶中，加水定容，摇匀；精密量取上述各容量瓶中的溶液2ml，分别加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，用取样器混匀；40℃水浴30min，取出并冷却至室温；分光光度计测定吸光值od490；以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作线性回归方程，葡萄糖标准曲线见图5。苯酚-硫酸法：吸取上清液300μl，稀释30倍后，并吸取2ml于50ml离心管中，量取3份；分别加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，摇匀；40℃水浴30min，取出并冷却至室温；分光光度计测定吸光值od490；根据标准曲线计算多糖含量。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12