一种用于贴壁培养细胞的培养基及其应用的制作方法

本发明涉及细胞培养领域，更特别地，涉及一种用于贴壁培养细胞的培养基及其应用，还涉及一种贴壁培养mdck细胞的方法以及由此得到mdck细胞培养物。
背景技术：
：mdck细胞系(mdckcelllines)由madin和darby于1958年从美国cockerspaniel母曲架犬的肾脏组织分离培育建立，通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞。mdck细胞系广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如：呼肠孤病毒、腺病毒、犬细小病毒、猫粒细胞缺乏症病毒及禽流感病毒等。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，mdck细胞系被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一。传统的mdck细胞培养大多采用有血清贴壁培养方式。血清的应用也存在许多问题：易受病毒、支原体或其他病原体的污染；批间差异造成产品批次间的质量难以严格控制；大量血清蛋白的存在增加了下游分离纯化的难度，部分蛋白难以通过分离纯化手段彻底去除，影响了产品的最终质量；此外，血清来源困难、价格昂贵，大规模动物细胞培养过程中使用血清将会大大增加生产成本。然而，如果培养基中不加血清，则会导致细胞无法贴壁。此外，现有的培养基培养的mdck细胞即便在同一批次中也是形态不一，铺展不完全，并且细胞内部折光性差，沉淀颗粒较多。因此，需要一种新的培养基用于培养mdck细胞。技术实现要素：为解决以上问题，本发明提供了一种用于贴壁培养细胞的培养基，其在基础培养基的基础上包含了贴壁诱导组分，所述贴壁诱导组分由以下物质组成：氢化可的松、胰岛素、前列腺素e1、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸。进一步地，所述贴壁诱导组分由以下物质组成：1-10×10-8mm氢化可的松、1-10μg/ml胰岛素、1-10×10-8mm前列腺素e1、1-10μg/ml转铁蛋白、1-10×10-12mm三碘甲状腺原氨酸。在一个优选实施方案中，所述基础培养基为dmem/f12培养基。在一个优选实施方案中，所述细胞为mdck细胞。本发明还提供了上述培养基在贴壁培养mdck细胞中的应用。本发明还提供了一种贴壁培养mdck细胞的方法，其包括使用上述培养基培养mdck细胞的步骤。本发明还提供了一种mdck细胞培养物，其通过上述方法得到。本发明的培养基中不含血清，但是仍然具有诱导细胞贴壁的功能，并且尤其适合用于贴壁培养mdck细胞，培养得到的贴壁细胞形态完整，呈现明显的上皮细胞样，细胞折光性好，内部无明显的颗粒沉淀物，可在疫苗研究中发挥更大的作用。附图说明图1为分别使用实施例1-4和传统培养基培养的mdck细胞贴壁后的显微照片。具体实施方式以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。1.无血清培养基的配制本发明的培养基通过将表1所示的成分添加至dmem/f12培养基中配制得到。表1向dmem/f12培养基中添加的成分实施例1实施例2实施例3实施例4氢化可的松(mm)1×10-84×10-88×10-810×10-8胰岛素(μg/ml)14810mm前列腺素e1(mm)1×10-84×10-88×10-810×10-8转铁蛋白(μg/ml)14810三碘甲状腺原氨酸(mm)1×10-84×10-88×10-810×10-82.mdck细胞的培养分别用上述实施例中配制得到的培养基培养mdck细胞，以传统的dmem+10％血清为对照，培养方法如下：复苏细胞，离心，弃上清，加入k-1培养基，培养细胞，待细胞密度生长至80％，进行传代。k-1培养基为无血清培养基，在胰蛋白酶消化后，需要离心去除胰蛋白酶，因为k-1没有血清，不能抑制胰蛋白酶的作用，故需要离心。3.细胞贴壁后显微镜检观察验证将上述培养得到的贴壁细胞放在显微镜下观察，结果如图1所示，使用传统培养基培养的mdck细胞形态不均一，铺展不完全，细胞内部折光性差，沉淀颗粒较多，而使用上述实施例培养得到的mdck细胞形态均一，贴壁后形态完整，呈现明显的上皮细胞样，细胞折光性好，内部无明显的颗粒沉淀物。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12