本发明属于微生物发酵
技术领域：
，具体涉及一种采用米曲霉发酵产苹果酸的工艺。
背景技术：
：苹果酸,又名羟基丁二酸、羟基琥珀酸或1-羟基乙烷二羧酸,分子式为c4h6o5，分子量134.09，结构式为hoocchohch2cooh。苹果酸具有右旋（d-型）和左旋（l-型）两种旋光异构体及dl-型外消旋体三种型式产品。其中l-苹果酸，广泛存在于生物体中，作为三羧酸循环的一员参与细胞代谢；d-苹果酸人体不易代谢，吸入或吞咽其对人体有害，作为手性合成的手性源，可以合成许多重要的有机化合物。l-苹果酸的生产最初是在培养黄曲霉时有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。后来，由糖类物质发酵来生产l-苹果酸，但是传统的发酵法生产l-苹果酸培养时间长、能耗大、产酸率低，糖的利用率不高，很难实现工业化生产。随着氨基酸行业逐步发展，发酵法生产技术l-苹果酸也有了长足的进步，但是l-苹果酸的工业平均转化率为70%-80%，尚有20%-30%富马酸残留，反应液中l-苹果酸的含量较低，大约为100g/l左右，目前国内尚无规模化的l-苹果酸生产方法。申请人之前的发明专利“一种直接发酵法生产l-苹果酸的方法”以及“一种l-苹果酸提取新工艺”通过优化工艺以及菌株合理配伍，大幅度提高了苹果酸的产量以及糖酸转化率，但是黄曲霉会产生一定量的黄曲霉素，产品中会残留黄曲霉毒素，后续分离步骤繁琐，增加了企业成本。鉴于上述缺陷，申请人之前的专利技术“一种制备l-苹果酸的方法”采用米曲霉发酵来制备苹果酸，其采用混合发酵的方式，取得了较好的苹果酸产率，本发明在该专利技术的基础上对发酵培养进行了改进，旨在于进一步提高苹果酸的产率。技术实现要素：针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种采用米曲霉发酵产苹果酸的工艺。本发明通过对菌株进行透过性处理，工艺简单，成本低廉，提高了苹果酸产量。本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：一种采用米曲霉发酵产苹果酸的工艺，其包括如下步骤：制备米曲霉种子液，发酵制备苹果酸，发酵过程中，添加碳酸钙和ctab，以及调整压强和温度。具体地，所述工艺包括如下步骤：1）将米曲霉菌液按照8％的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养12h得到种子液；2）按照种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养48h，然后添加碳酸钙和ctab，继续发酵36h，然后控制温度为39-40℃，压强为2-3个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到苹果酸发酵液；发酵过程中，控制ph为6.2，控制残糖浓度不低于1.0wt％。优选地，所述碳酸钙的添加量为80g/l，ctab的添加量为30-40mg/l。优选地，所述种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，ph值6.0。优选地，所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米浆12g/l，硫酸铵2g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，七水硫酸亚铁0.01g/l，ph值6.2。所述米曲霉为米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。本发明的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：本发明对现有菌株进行通透化处理，提高了苹果酸的产率；本发明通过提高培养温度，可增加分子扩散的速度；增加压力对细胞的挤压作用增强,细胞表面发生轻微变形,细胞膜的通透性增加；培养过程后期加入合适剂量的ctab，干扰细胞壁的合成，改善菌体细胞壁和细胞膜对催化反应中底物和产物的传质限制，同时调整合适的浓度，避免终浓度过低，达不到透性化改造的目的，终浓度过高则可能导致细胞死亡或生长停滞；本发明通过添加ctab结合温度压强的改变，实现菌株培养与透性化处理的耦合，可以在不需要对培养好的细胞进行后续透性化处理的情况下减小菌体细胞壁和细胞膜对底物和产物的传质限制，避免后续透性化处理细胞的步骤及相关设备运转的投入，为提高苹果酸产量提供了一个简便方法；本发明发酵工艺中添加碳酸钙来维持培养液中碳酸钙的浓度，提高了米曲霉的发酵效率。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。实施例1一种采用米曲霉发酵产苹果酸的工艺，其包括如下步骤：将米曲霉(aspergillusoryzae)菌液（浓度为1×108cfu/ml)按照8％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养12h得到种子液，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，ph值6.0；按照种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养48h，然后添加碳酸钙和十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，碳酸钙的添加量为80g/l，ctab的添加量为30mg/l，继续发酵36h，然后控制温度为39℃，压强为2个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到苹果酸发酵液；发酵过程中，通过自动流加氨水控制ph在6.2；并通过流加浓度为200g/l的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％；所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米浆12g/l，硫酸铵2g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，七水硫酸亚铁0.01g/l，ph值6.2；所述米曲霉为米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。实施例2一种采用米曲霉发酵产苹果酸的工艺，其包括如下步骤：将米曲霉(aspergillusoryzae)菌液（浓度为1×108cfu/ml)按照8％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养12h得到种子液，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，ph值6.0；按照种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养48h，然后添加碳酸钙和十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，碳酸钙的添加量为80g/l，ctab的添加量为40mg/l，继续发酵36h，然后控制温度为39℃，压强为3个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到苹果酸发酵液；发酵过程中，通过自动流加氨水控制ph在6.2；并通过流加浓度为200g/l的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％；所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米浆12g/l，硫酸铵2g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，七水硫酸亚铁0.01g/l，ph值6.2；所述米曲霉为米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。实施例3各因素对米曲霉发酵苹果酸产量的影响：l-苹果酸的测定：采用2,7—萘二酚显色法，取样品溶液1.0ml，加入6.0ml分析纯的浓硫酸，再加入0.1ml2,7—萘二酚溶液，接着在100℃水浴中加热20min，取出待冷却至室温后，于385nm下进行比色测定，以蒸馏水作对照校正仪器零点。用标准样品先作标准曲线，以苹果酸含量为横坐标，385nm处吸收值即od385为纵坐标，通过未知样品在385nm处的od值，则可在标准曲线上查得相应的苹果酸含量。设置对照组，其中，对照组1：发酵过程不提高温度和压强，其余同实施例1；对照组2：不添加ctab，其余同实施例1；试验组分别为实施例1和实施例2。各组别发酵液中苹果酸的产量见表1：表1组别对照组1对照组2实施例1实施例2苹果酸产量（g/l）89.195.7130.5133.1实施例4一、压强梯度试验：针对发酵后期12小时内，选择1-5大气压进行测试，其余实验流程同实施例1，具体发酵结果见表2：表2大气压强度12345苹果酸产量（g/l）115.3130.5132.7121.4109.8二、温度梯度试验：针对发酵后期12小时内，选择33-43℃进行测试，其余实验流程同实施例2，具体发酵结果见表3：表3温度℃333537394143酸产量（g/l）102.6113.9123.4133.1118.5105.7结论：适当提高温度或压强可以增加菌株细胞壁的透过性，从而提高苹果酸产量，压强或温度过高时，可能会导致菌株活力降低或者死亡，从而导致苹果酸量下降。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12