本发明属于生物技术领域，涉及一个来自禾谷孢囊线虫基因ha-16674基因序列和编码蛋白及其应用。
背景技术：
小麦禾谷孢囊线虫(heteroderaavenae)是危害小麦、大麦、燕麦等禾本科作物的重要病原线虫，目前已在37个国家如美国、加拿大、澳大利亚、法国、英格兰、挪威、意大利、印度、土耳其、叙利亚、伊朗等国家发生(nicolj,
近10年来，我国小麦主产区的小麦禾谷孢囊线虫病害发生日趋严重。自1989年，首次在湖北天门发现小麦禾谷孢囊线虫以来，目前已明确小麦禾谷孢囊线虫已经在河南、河北、北京、天津、内蒙古、山东、山西、湖北、安徽、江苏、宁夏、青海、西藏和新疆等16个省、市、自治区小麦产区均有发生分布；发生面积达到6000余万亩，其中河南省发生面积约2000万亩，河北省约1000万亩，山东省约2000万亩、安徽省约600万亩，江苏省约400万亩(彭德良,李惠霞,王锡锋,etal.我国小麦禾谷孢囊线虫的新发生分布地区[j].中国线虫学研究,2008,2:344-345.)，而且有不断加速蔓延的趋势。河南许昌和郑州重病田小麦减产达40％以上，许多麦田的线虫密度显示达到高风险指标，甚至部分麦田因病情危害严重而毁种绝收。小麦禾谷孢囊线虫病害已成为制约我国小麦高产丰产的重要因素之一(deliangp,nicoljm,hongmeil,etal.currentknowledgeofcerealcystnematode(heteroderaavenae)onwheatinchina[c].cerealcystnematodes:status,researchandoutlook.proceedingsofthefirstworkshopoftheinternationalcerealcystnematodeinitiative,antalya,turkey,21-23october2009.,2009:29-34)。目前随着跨区联合收割机的普遍推广，使小麦禾谷孢囊线虫在我国小麦主产区大面积、远距离传播和扩散，已经成为我国华北、西北和西南麦区区域性的小麦生产的重大危险性病害，严重威胁着我国的粮食安全。
目前，小麦孢囊线虫病害的防治主要依赖化学农药，一方面对环境产生巨大污染，另一方面可能产生抗药性线虫种群，因此小麦孢囊线虫病害亟需绿色防治策略。选育和推广种植抗病品种小麦是控制小麦孢囊线虫病害的有效的措施，但是抗病品种也有一定的缺陷，例如无法将抗病和高产表型相结合。随着分子生物学技术的发展，深入了解小麦孢囊线虫致病机理有利于开发高效、绿色的综合防控策略。因此挖掘禾谷孢囊线虫致病基因，研究其致病机理，为培育抗性植物提供靶标具有十分重要的实践意义和理论价值。
技术实现要素：
本发明提供一种与禾谷孢囊线虫致病性相关的效应基因ha-16674及其编码蛋白，为抗线虫植物的培育提供新的靶标，对抗线虫作物的培养有良好的理论指导意义。
本发明的目的提供一种来自禾谷孢囊线虫的ha-16674基因序列及其编码蛋白。
本发明另一目的提供了一种来自禾谷孢囊线虫ha-16674基因编码及其编码蛋白的应用。
上述目的通过以下技术方案实现：
一种禾谷孢囊线虫ha-16674蛋白，其氨基酸列seqidno：1所示。
编码上述蛋白的基因。
所述基因，其cdna全长核苷酸序列如seqidno：2。
一种重组载体或转基因个体，含有上述基因序列。
所述重组载体的骨架载体为含有35s启动子的pgd载体。
禾谷孢囊线虫ha-16674基因在线虫防治中的应用。
ha-16674基因抑制植物免疫防御反应，通过沉默ha-16674基因降低线虫的侵染率，ha-16674基因可以作为靶标应用到线虫病害的防治中。
本发明通过pcr克隆得到了ha-16674完整的编码区1236bp，编码411个氨基酸的蛋白。
一种重组载体含有ha-16674基因序列，一般植物表达载体均可，本发明选择含有35s启动子的pgd载体。一种重组菌，含有上述重组载体。
对于含有上述禾谷孢囊线虫基因ha-16674的重组基因表达盒、转基因细胞系等也应属于本发明的保护范围。
本发明通过大量的实验研究，获得了一种谷孢囊线虫基因ha-16674及其编码蛋白，明确了其在线虫寄生中的功能。ha-16674的cdna全长1236bp，编码411个氨基酸的蛋白。将bax注射烟草叶片会引起大面积细胞死亡，ha-16674与bax共注射烟草叶片，可以抑制bax引起叶片的细胞死亡。
本发明收集接种二龄幼虫后不同时间段的小麦根，通过根破碎和蔗糖离心，获得侵染后j2、j3、j4和白雌虫等不同发育期的虫体。利用ha-16674特异引物，realtime-pcr检测ha-16674基因在小麦禾谷孢囊线虫不同发育期的表达量。结果显示结果ha-16674在各龄期均有表达，其中侵染后二龄幼虫中表达量最高，是卵中表达量的80多倍。
拟南芥中ha-16674基因全长超表达，获得稳定遗传的t3代转基因阳性植株。ha-16674转基因植物形态与野生型一致，无明显变化。接种丁香假单胞杆菌(pseudomonassyringae)后，与野生型相比，超表达ha-16674的拟南芥对p.syringae的敏感性增强，说明禾谷孢囊线虫的钙网蛋白ha-16674可降低拟南芥的免疫防御反应，促进丁香假单胞杆菌侵染。
本发明明确了ha-16674在线虫寄生中的功能。ha-16674可以抑制植物的细胞死亡，ha-16674在侵染后二龄表达量增高，通过抑制寄主的基础免疫防御反应来促进寄生。初步确定ha-16674通过抑制植物的过敏性细胞坏死，从而调控植物的基础免疫防御反应。为ha-16674作为线虫防治靶标提供了理论依据，也为进步研究线虫效应蛋白调控寄主免疫防御反应的机制提供思路。
本发明为抗线虫植物的培养提供了新靶标ha-16674，对培育广谱抗孢囊线虫作物具有良好的的理论指导意义。同时明确了ha-16674在寄生中的功能，为孢囊线虫与寄主互作机制的研究提供了新思路和方向。
附图说明
图1为ha-16674基因电泳结果。
图2为ha-16674在烟草中表达抑制bax引起的细胞死亡。a:bax单独注射；b:bax和ha-16674共注射；c:bax和空载体pgd共注射；d:ha-16674单独注射。
图3为ha-16674在不同龄期的发育表达模式。横坐标为禾谷孢囊线虫的卵、二龄、侵染后二龄、三龄、四龄和雌成虫六个不同龄期，纵坐标为ha-16674基因的相对表达量
图4为超表达ha-16674拟南芥对丁香假单胞菌敏感性增强。col为野生型拟南芥，oeha-16674为超表达ha-16674基因的拟南芥。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，本发明所用的材料均为市售，本申请人同时可以对公众发放所用到的生物材料。
实施例1:禾谷孢囊线虫线虫ha-16674基因序列的获得
1.1线虫总rna的提取
取约100,000头二龄幼虫，在液氮中充分研磨后，加入1mltrizol试剂，室温5min；加入200μl氯仿，颠倒充分混匀后，室温5min；12000g，4℃，离心15min；上清转移至离心管后，加入600μl异丙醇，颠倒充分混匀后，室温10min；12000g，4℃，离心15min；去上清，加入1ml75％乙醇洗涤沉淀，7500g离心5min，去上清；75％乙醇洗涤沉淀重复一次；室温干燥沉淀；rnase-free水溶解rna，保存于-80℃冰箱。线虫rna反转录合成cdna第一链。
1.2ha-16674基因序列的pcr扩增
设计引物ha-16674f：atgcttagtgctcccccactg；
ha-16674r：ctaaagttcgtcgtgctcctcc。
扩增体系：primestarmaxpremix(2×)25μl，ha-16674f(10mm)2μl，ha-16674r(10mm)2μl，cdna1μl，双蒸水20μl总体积补至50μl；扩增程序：98℃，5min；98℃，10s，56℃，10s；72℃，1min，35个循环，72℃，10min，16℃保存。pcr扩增后，1％的琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物后，切割电泳条带使用dna凝胶回收试剂盒(promega)按照说明书的步骤进行回收。回收的dna片段克隆至peasy-bluntvector，反应体系：pcr产物0.5-4μl，peasy-bluntvector1μl，ddh2o补至5μl，轻轻混合，25℃反应1h。反应结束后，置于冰上；将连接产物热击转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，重组子在含卡纳青霉素kan50μg/mllb平板上菌落pcr验证后，送公司测序。其核苷酸序列如seqidno：2所示，其编码的蛋白序列如seqidno：1所示。本发明所用的peasy-bluntvector为商业化载体。
实施例2:禾谷孢囊线虫线虫ha-16674抑制细胞死亡
2.1ha-16674植物表达载体构建
表达序列全长扩增正向引物5′端起始于atg(起始密码子)并连接xhoi酶切位点序列，反向引物3′端终止于tga(终止密码子)并-连接bamhi酶切位点序列。以含有ha-16674基因序列的t载体为模板，用高保真酶primestardnapolymerase扩增目的片段。
ha-16674f(xho1):ccgctcgagatgcttagtgctcccccactg
ha-16674r(pst1):aaaactgcagctaaagttcgtcgtgctcctcc
扩增体系：primestarmaxpremix(2×)25μl，ha-16674f(10mm)2μl，ha-16674r(10mm)2μl，t载体1μl，双蒸水20μl总体积补至50μl；扩增程序：98℃，5min；98℃，10s，56℃，10s；72℃，1min，35个循环，72℃，10min，16℃保存。pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收。双酶切pcr和pgd质粒酶切体系：10×buffer3.15μl，xhoi0.5μl，bamhi0.5μl，dna或质粒2μg，超纯水补至50μl，37℃条件下反应1h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的片段。酶切片段连接反应10×ligationbuffer1μl，t4dnaligase1μl，载体100ng，目的片段dna100ng，双蒸水补至10μl，连接反应4℃过夜，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞dh5α，在含有50μg/ml卡纳青霉素lb平板上筛选阳性克隆，菌落经pcr验证后，送公司测序。
利用ha-16674特异引物扩增得到的ha-16674基因序列长1236bp，测序得到的序列含有完整的开放阅读框(orf)，编码411个氨基酸的蛋白。
2.2烟草注射瞬时表达法
含ha-16674序列的植物表达载体pgd电击转化至农杆菌eha105，挑取单克隆于50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平液体lb中培养；220rpm，28℃震荡培养，18h；4000rpm离心20min，收集菌体用mes(10mmmgcl2,10mmmes,ph5.6,150umas)缓冲液重悬菌体，浓度od＝0.7；室温静置2-3h后注射烟草；1ml注射器吸取菌液，注射到7-8周烟草叶片内；先注射含有bax，24h后在注射bax1叶片区域注射ha-166741；注射后3-5d，观察细胞凋亡情况。见图2。
烟草中的瞬时表达发现，单独注射bax会引起烟草叶片大面积细胞死亡，ha-16674与bax共注射烟草叶片，细胞死亡被抑制，因此ha-16674可以抑制bax引起叶片的细胞死亡。实施例3:禾谷孢囊线虫线虫ha-16674发育表达模式
3.1不同龄期幼虫的分离
大量二龄幼虫接种于生长7天的小麦(温麦19)幼苗；分别在接种后7天、20天和30天的收集小麦根；收集侵染的根，用水彻底清洗干净后，剪成尽量小的碎片；加入3倍体积的酶溶解液，25℃,180rpm,摇动裂解16h；用筛子分离残渣，收集不同龄期的幼虫；残渣2000rpm，离心5min，加70％蔗糖，悬浮残渣后，滴加5-10ml清水，2000rpm,离心5min；收集侵染后二龄、三龄、四龄期的线虫；雌成虫直接从接种后40天的根上获得。
3.2rna提取与模板合成
二龄、侵染后二龄、三龄、四龄期、雌成虫和卵利用磁珠法提取总rna，方法参照dynabeadsmrnadirecttmkit手册,反转录合成cdna。
内参引物gapdh-qs1：agcggcacagaacatcatcc；
gapdh-qas1：ggtcctccgtgtagcccaaa；
ha-16674特异性引物
ha-166740qf1：caccgtcaaacacgagcagaata；
ha-166740qr1：tctttgcgtctgggtctgggata。
3.3实时定量pcr
试剂使用takara公司sybrgreenrealtimepcrmastermix，仪器使用abi7500。扩增体系：2×sybrgreenmix20μl；prime1(10mm)2μl，prime2(10mm)2μl，cdna模板1μl，总体积25μl。扩增程序：95℃30sec；95℃15sec，60℃15sec，72℃45sec，95℃15sec，40cycle；60℃60sec；95℃15sec；60℃30sec。实验重复三次以上。
利用ha-16674特异性引物，realtime-pcr检测ha-16674基因在小麦禾谷孢囊线虫不同发育期的表达量。结果显示结果ha-16674在各龄期均有表达，其中侵染后二龄幼虫中表达量最高，明显高于其他龄期。
实施例4拟南芥超表达ha-16674对丁香假单胞菌敏感性增强
4.1花序浸泡法获得转基因拟南芥：
植物表达载体pyba1143:ha-16674的构建:
引物：ha-16674f1(pst1):aaaactgcagatgcttagtgctcccccactg
ha-16674r1(xho1):ccgctcgagctaaagttcgtcgtgctcctcc
扩增体系：primestarmaxpremix(2×)25μl，ha-16674f1(10mm)2μl，ha-16674r1(10mm)2μl，t载体1μl，双蒸水20μl总体积补至50μl；扩增程序：98℃，5min；98℃，10s，56℃，10s；72℃，1min，35个循环，72℃，10min，16℃保存。pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收。双酶切pcr和pyba1143质粒酶切体系：10×buffer3.15μl，xhoi0.5μl，bamhi0.5μl，dna或质粒2μg，超纯水补至50μl，37℃条件下反应1h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的片段。酶切片段连接反应10×ligationbuffer1μl，t4dnaligase1μl，载体100ng，目的片段dna100ng，双蒸水补至10μl，连接反应4℃过夜，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞dh5α，在含有50μg/ml卡纳青霉素lb平板上筛选阳性克隆，菌落经pcr验证后，送公司测序。
pyba1143:ha-16674转入农杆菌gv3101后，挑单克隆摇菌；含有重组质粒的农杆菌菌液以1:200转入含有卡纳青霉素50μg/ml和50μg/ml利福平lb培养基，220rpm，28℃过夜振荡培养；菌液室温下4000rpm离心15min，弃去上清液；5％蔗糖溶液重悬菌体，加入0.03％的silwetl77，混合均匀制成转化液；将待转化拟南芥植株上的果荚剪去，留下花序；将拟南芥植株花序朝下蘸泡转化液中约30s；转化后的植物保持湿度，在黑暗中放置16h后，16h光照/8h黑暗培养；一周后重复一次转化，以高转化率；转化植株成熟后，收种子t1代，将得到的种子用1％升汞进行表面消毒后，播种在含50μg/ml的ms培养基上，筛选抗性苗；种子在抗性培养基上生长两周之后，将有卡纳青霉素抗性的拟南芥幼苗移栽到土中继续培养收获种子。
将ha-16674基因全长构建到植物表达载体pyba1143，在拟南芥中超表达，获得稳定遗传的t3代转基因阳性植株。ha-16674转基因植物形态与野生型一致，无明显变化。
4.2ha-16674转基因植株接种丁香假单胞菌
pstdc3000在含有100mg/l利福平，50mg/l卡纳青霉素，25mg/l链霉素5-12mg/l四环素的kbm平板上划线，28℃培养2d，挑选单克隆接种于20mlkbm液体培养基摇菌，28℃过夜；4000rpm离心5min收集菌体，用等体积的10mmmgcl2洗2次；用10mmmgcl2稀释至od600＝0.001(相当于106cfu/ml)；选择未抽苔的拟南芥，嫩绿且完全展开的叶片，注射菌液。
接种丁香假单胞杆菌(pseudomonassyringae)后，与野生型相比，超表达ha-16674的拟南芥对p.syringae的敏感性增强，说明小麦禾谷孢囊线虫的ha-16674可降低拟南芥的免疫防御反应，促进丁香假单胞杆菌侵染。
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<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>禾谷孢囊线虫ha-16674蛋白、编码基因及其应用
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