基于水溶性荧光聚合物快速灵敏检测MicroRNA的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于水溶性荧光聚合物快速灵敏检测microrna的方法。

背景技术：

微小rna(microrna)是一种碱基数目为19～23个的非编码的小分子rna，广泛存在于动植物及病毒体内，microrna与生物体的多种生理过程密切相关，包括生长发育、免疫防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和调亡、脂肪代谢、肿瘤发展等。了解microrna的调节作用及microrna表达与人类疾病之间的关系已经引起了研究者极大兴趣。calin等首次发现了microrna的表达与人类肿瘤的发生密切相关，并且已经发现microrna的表达在多类肿瘤中发生改变，一些microrna可以直接或间接作为肿瘤抑制基因或者作为癌基因。发展microrna检测方法对于理解microrna的功能、临床诊断以及发现新的靶标基因药物是非常重要的。

基于核酸直接杂交检测microrna的方法包括northern印迹法、微阵列芯片法及原位杂交法。由于microrna的一些固有特性：microrna的尺寸小、序列同源性高以及在细胞中的浓度低，基于核酸直接杂交检测microrna方法具有操作繁琐、耗时过长、样品需要量大以及灵敏度和特异性不令人满意等缺点。为了提高microrna检测的灵敏度和特异性，研究者们开发了多种信号放大技术用于microrna检测，例如反转录-聚合酶链反应(rt-pcr)、连接酶链式反应(lcr)、滚环扩增技术(rca)、恒温指数扩增技术(iexpar)、链置换扩增技术(sda)等。其中rt-pcr、lcr两种技术为变温反应，需要依赖精密的热循环仪，在升降温过程中如果温度控制不合适，会引起扩增失败。而且这些技术都需要有酶的参与，即一种扩增技术需要一种酶甚至多种酶结合进行催化，否则扩增反应不能发生，同时这些扩增技术还需要对引物及探针序列进行复杂精细的设计，以及对实验操作提出较高专业性要求。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种成本低廉、操作简单，基于水溶性荧光聚合物快速灵敏检测microrna的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、设计合成探针sh-dna和探针acrydite-dna

根据目标microrna的碱基序列，分别设计合成与目标microrna中8～13个碱基序列互补的探针sh-dna和探针acrydite-dna，其中探针sh-dna的3’端修饰巯基，探针acrydite-dna的5’端修饰丙烯酰胺基，且这两条探针的碱基数目相差0～3个；当探针sh-dna和探针acrydite-dna与目标microrna互补后，探针sh-dna的5′端和探针acrydite-dna的3′端相互毗邻，且这两条探针与目标microrna互补的碱基数目之和与目标microrna的碱基数目相同，同时探针sh-dna的3’端和探针acrydite-dna的5’端分别带有3～5个与目标microrna互补的碱基相毗邻的碱基t。

2、巯基标记金磁微粒

将探针sh-dna用磷酸三氯乙酯活化，活化后的sh-dna与金磁微粒结合，得到巯基标记的金磁微粒(sh-金磁微粒)。

3、合成dna功能化的水溶性荧光聚合物

以过硫酸铵(aps)和n,n,n’,n’-四甲基乙二胺(temed)的混合物为引发剂，将丙烯酰胺、丙烯酰基荧光素、探针acrydite-dna进行无规共聚，得到dna功能化的水溶性荧光聚合物。

4、荧光检测目标microrna

将步骤2得到的巯基标记的金磁微粒和步骤3得到的dna功能化的水溶性荧光聚合物与不同浓度的目标microrna标准样品进行杂交反应，经磁分离得到杂交产物，对杂交产物经去杂交、磁分离后所得到的上清液进行荧光检测，绘制荧光强度随目标microrna标准样品浓度变化的标准曲线；按照该步骤检测待测microrna样品的荧光强度，结合绘制的标准曲线的线性方程，即可实现对microrna的定性和定量检测。

上述步骤3中，优选丙烯酰胺、丙烯酰基荧光素、探针acrydite-dna的摩尔比为10000:1000:1。

上述步骤4中，优选杂交反应的温度为30～40℃，杂交时间为60～120分钟。

上述步骤4中，所述荧光检测的激发波长为494nm、发射波长为512nm。

本发明的检测原理如图1所示，sh-dna通过au-s键自组装到金磁微粒的表面，形成sh-金磁微粒；acrydite-dna、丙烯酰基荧光素及丙烯酰胺在引发剂aps和temed存在下发生聚合反应，形成可识别目标microrna的dna功能化的水溶性荧光聚合物。当有目标microrna存在时，microrna同时与sh-dna及acrydite-dna发生碱基互补配对，经过磁分离去掉未配对的荧光聚合物后，用naoh水溶液去杂交，去杂交后dna功能化的水溶性荧光聚合物从金磁微粒上脱离，分散在naoh水溶液中，磁分离后，收集上清液，测定上清液的荧光强度，目标microrna的浓度越大，荧光强度越大。

本发明的有益效果如下：

1、本发明建立了一种基于水溶性荧光聚合物信号放大作用直接检测目标microrna的荧光分析方法，该方法所用dna功能化的水溶性荧光聚合物的聚合物链中标记的荧光素基团多，可以将检测的荧光信号进行多倍放大，实现对检测信号的第一级放大。同时，由于荧光报告基团受到聚合物的包裹和保护，降低了碰撞猝灭，实现了检测信号的第二级放大。

2、本发明根据目标microrna的不同可以设计不同acrydite-dna与sh-dna序列，达到检测不同种类microrna的目的，而且本发明检测方法的检出限低、选择性高。同时，该方法无需对目标microrna进行扩增，检测成本和专业性要求低，操作步骤简单，分析速度快。

附图说明

图1是本发明方法检测microrna的原理图。

图2是本发明方法检测microrna-21的工作曲线。

图3是本发明方法的选择性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

以检测microrna-21(其碱基序列为5'-uagcuuaucagacugauguuga-3')为例，具体检测方法如下：

1、设计合成探针sh-dna和探针acrydite-dna

根据目标microrna-21的碱基序列，分别设计合成探针sh-dna和探针acrydite-dna，其中探针sh-dna的碱基序列为5'-ctgataagctattttt-sh-3'，探针acrydite-dna的碱基序列为5'-acrydite-ttttttcaacatcagt-3'，acrydite代表丙烯酰胺基。

2、巯基标记金磁微粒

将10μl100μmol/l探针sh-dna的pbs缓冲液(ph＝7.4，10mmol/l)置于500μl离心管中，再加入10μl10mmol/l磷酸三氯乙酯的水溶液，常温活化1小时，然后将活化后的sh-dna溶液加入到1ml1mg/ml金磁微粒分散液(金磁微粒分散于水中制成)中，常温振荡16小时后，加入100mmol/lph＝7.4的pbs缓冲液使所得混合液中pbs浓度为10mmol/l，继续振荡1小时，分三次加入1mol/lnacl水溶液，每次加完后静置6小时，使最终混合液中nacl的浓度为0.1mol/l；最后在磁分离架上静置并进行磁分离，将所得上清液用移液枪吸出，固体用10mmol/lph＝7.4的pbst缓冲液(含体积分数为0.05％吐温-20、0.1mol/lnacl)洗涤3次后分散于1ml10mmol/lph＝7.4的pbs缓冲液中，得到巯基标记的金磁微粒分散液。

3、合成dna功能化的水溶性荧光聚合物

将3.0000g(9×10^-3mol)荧光素完全溶解于盛有20.00ml干燥的二氯甲烷的圆底烧瓶中，再加入3.00ml三乙胺，磁力搅拌，在冰水浴中充分冷却；将0.90ml丙烯酰氯溶解于20.00ml二氯甲烷后滴加至圆底烧瓶中，待其在冰水浴中滴加完成后，常温搅拌反应24小时。反应结束后，旋蒸除去部分二氯甲烷后，倾入大量水中，析出沉淀，过滤，干燥后，在乙醇中重结晶，得到橙黄色的丙烯酰基荧光素。

将7.1mg(1×10^-4mol)丙烯酰胺、26μl(1×10^-5mol)丙烯酰基荧光素、30μlph＝8的tris-hcl缓冲液、5μl2mol/l的nacl水溶液、5μl0.1mol/l的十二烷基磺酸钠水溶液、100μl100μmol/l探针acrydite-dna的tris-hcl缓冲液(ph＝8)加入1.5ml离心管中，通氩气2分钟后，加入5μl引发剂(按每毫升水中加入0.1g过硫酸铵和0.1mln,n,n’,n’-四甲基乙二胺配制而成)，常温聚合24小时后，将所得聚合液依次用乙醇和水透析，直到透析液中没有荧光为止，以除去未聚合的单体，最后将其冷冻干燥24小时，得到橘黄色dna功能化的水溶性荧光聚合物。经高效凝胶色谱仪(ultimate3000)测定，该水溶性荧光聚合物的数均分子量为109883，多分散指数2.86。

4、荧光检测microrna

向5个1.5ml离心管中分别加入10μl步骤2得到的巯基标记的金磁微粒分散液，再依次向5个离心管中加入10μl10^-14mol/l、10^-13mol/l、10^-12mol/l、10^-11mol/l、10^-10mol/lmicrorna-21水溶液，然后再加入20μl步骤3得到的dna功能化的水溶性荧光聚合物的pbs缓冲液(10mmol/l，ph＝7.4)和160μl10mmol/lph＝7.4的pbs缓冲液(含100mmol/lnacl、10mmol/lmgcl2)，所得混合溶液在30℃水浴中孵育90分钟，使探针sh-dna和探针acrydite-dna与microrna-21充分杂交。待杂交完成后，将离心管放在磁分离架上静置3分钟进行磁分离，将所得上清液用移液枪吸出，杂交产物用10mmol/lph＝7.4的pbst缓冲液(含体积分数为0.05％吐温-20、0.1mol/lnacl)洗涤3次，再加入200μl0.15mol/l的naoh水溶液将其浸泡15分钟进行去杂交，去杂交后再进行磁分离，所得上清液采用rf-5301型荧光分光光度计在激发波长为494nm、发射波长为512nm下进行荧光检测，绘制荧光强度随microrna-21浓度变化的标准曲线，结果见图2。

由图2可见，荧光强度与microrna-21的浓度之间存在良好的线性关系，其线性回归方程为y＝83.17lgc+1231.62，式中c为microrna-21的浓度(单位mol/l)，y为荧光强度，相关系数r²为0.9943。按iupac建议，根据3σ，计算出该方法的检出限为1.44fmol/l。实验结果表明，该方法对microrna-21具有高灵敏检测的能力。

为了证明本发明检测方法的选择性，发明人采用实施例1的方法分别对microrna-21(5'-uagcuuaucagacugauguuga-3')、单碱基错配的microrna(5'-uagcuuaucagaccgauguuga-3')、三碱基错配的microrna(5'-uagccuaucagaccgaaguuga-3')、任意序列的microrna(5'-cugaccuaugaauugacagcca-3')进行了检测，结果见图3。由图3可见，microrna-21对应体系产生较强的荧光信号，将其定为100％时，单碱基错配的microrna以及三碱基错配的microrna对应体系的荧光强度分别为33％和14％，任意序列的microrna对应体系的荧光强度与空白基本相同，表明该方法能够很好的区分这四种核酸序列，从而实现对目标microrna的选择性检测。

核苷酸或氨基酸序列表

[0001]

序列表

<110>陕西师范大学

<120>基于水溶性荧光聚合物快速灵敏检测microrna的方法

<160>6

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>待测microrna-21序列

<400>1

uagcuuaucagacugauguuga22

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>根据待测microrna-21序列设计的探针sh-dna，以用作磁分离杂交产物

<400>2

ctgataagctattttt16

<210>3

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>根据待测microrna-21序列设计的探针acrydite-dna，以用作识别检测microrna-21

<400>3

ttttttcaacatcagt16

<210>4

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>单碱基错配的microrna，作为检测microrna-21时的选择性的对比序列

<400>4

uagcuuaucagaccgauguuga22

<210>5

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>三碱基错配的microrna，作为检测microrna-21时的选择性的对比序列

<400>5

uagccuaucagaccgaaguuga22

<210>6

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>任意序列的microrna，作为检测microrna-21时的选择性的对比序列

<400>6

cugaccuaugaauugacagcca22