一种检测CALR基因2型突变的引物组合物及试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种检测calr基因2型突变的靶序列、扩增组合物及试剂盒。

背景技术：

骨髓增殖性肿瘤(mpn)是骨髓中一种或多种髓系细胞增殖和外周血中成熟及不成熟细胞增加的克隆性造血干/祖细胞疾病。近年来，多个分子标志物，如jak2、mpl和tet突变等相继被发现，这些标志物的发现对于理解mpn的分子发病机制具有重要意义，也有助于对这类疾病的患者进行诊断和治疗。但是，有30％～45％的携有野生型jak2/mpl的原发性血小板增多症(et)或原发性骨髓纤维化(pmf)患者仍然存在诊断困难，新近报道的钙网蛋白基因(calr)突变将能部分填补这一空白，有望成为诊断骨髓增殖性肿瘤又一种新的分子标志物。

calr是一种主要位于内质网的有多重功能的钙离子结合和储存蛋白分子伴侣，通过协助蛋白质正确折叠和维持细胞钙离子稳态而参与调节细胞增殖、凋亡、黏附、免疫等过程。calr基因定位于染色体19p13.2，它有9个外显子和9个蛋白结构域，calr基因突变是由第九外显子插入和缺失引起，导致一个碱基对的读码框移位，继而产生一种具有缺乏内质网保留序列(kdel氨基酸序列)的新型的c-羧基末端的蛋白,到目前为止，已经检测到多于40种不同的calr突变体,其中最常见的两种变异体分别为：由52个碱基缺失引起的1型变异体(p.l367fs*46)和由5个碱基ttgtc插入引起的2型变异体(p.k385fs*47)，它们分别占所有突变体的53％和32％，研究者在体外实验中发现，过度表达的1型突变体增强了白介素-3表达，也促进了stat5磷酸化作用并且引起信号传导的激活，这种激活作用能被jak抑制剂阻滞，这说明calr和jak2突变可能有类似的机制。

当前calr基因突变的检测主要依赖于探针实时pcr法或测序法等，以上方法耗时耗力、报告周期长，且在灵敏度方面存在缺陷，所需检测设备昂贵，检测时必须要有专门的设备和训练有素的技术人员，对技术平台要求高，不易于广泛推广。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，建立了一种针对calr基因2型突变进行快速检测的环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)体系。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种检测calr基因2型突变的靶序列的引物组合物，其包括seqidno：2-seqidno：7所示序列的引物。

本发明还提供一种含有上述引物组合物的检测calr基因2型突变的试剂盒。

优选地，上述试剂盒还包括反应缓冲液、bstdna聚合酶、钙黄绿素、去离子水、dna模板。

优选地，上述试剂盒包含25μl扩增反应体系，该扩增反应体系包括包括2×反应缓冲液12.5μl，seqidno：2～seqidno：4所示序列中的每一引物各0.5μl，seqidno：5～seqidno：7所示序列中的每一引物各1μl，bstdna聚合酶1μl，钙黄绿素1μl，去离子水4.0μl，dna模板2μl。

优选地，在上述试剂盒中，seqidno：2～seqidno：3所示序列中的每一引物的终浓度均为0.2μmol/l；seqidno：4所示序列的引物的终浓度均为0.8μmol/l；seqidno：5所示序列的引物的终浓度均为1.6μmol/l；seqidno：6～seqidno：7所示序列中的每一引物的终浓度均为0.8μmol/l；。

本发明还提供一种用于非诊断和非治疗目的的检测calr基因2型突变的方法，该方法以被测样本的dna模板，采用上述引物组合物进行lamp反应，然后进行可视化判读来鉴定样本是否为calr基因2型突变阳性。

优选地，所述lamp反应的条件为：65℃，60min。

优选地，所述lamp反应所用的设备为能够稳定提供65℃恒温的设备，例如普通pcr仪或恒温金属浴等。

最后，本发明提供一种上述引物组合物扩增的calr基因2型突变的靶序列，其由seqidno：1所示序列组成，并且提供一种含有上述calr基因2型突变的靶序列的重组质粒，该重组质粒为含seqidno：1所示序列的ta克隆质粒。

上述引物及靶序列的碱基序列如下表1所示。

表1检测calr基因2型突变的引物及靶序列的碱基序列表

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述的calr基因2型突变进行快速检测的试剂盒和环介导等温扩增方法，其可对calr基因2型突变进行可视化检测，与传统的检测方法相比，该方法对设备和环境要求低，检测速度更快，检测灵敏度更高。

附图说明

图1是calr基因2型突变lamp体系特异性的验证示意图；

图中附图标记为：

b1：临床calr-1突变阳性基因组dna；b2：临床calr-2突变阳性基因组dna；b3：临床calr野生型基因组dna；b4：calr-1突变阳性质粒；b5：calr-2突变阳性质粒；b6：calr野生型质粒；b7：空白对照。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为本发明所采用的calr基因2型突变的靶序列，以及用于检测calr基因2型突变的引物。

在calr基因2型突变的位置周围选定检测的靶片段，利用在线的lamp引物设计网站primerexplorerv5(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)针对靶片段，设计适当的特异性引物。

(1)引物序列为：

f3：tcctggtcctgatgtcgg(seqidno：2)；

b3：ctcctcatcctcctcatcct(seqidno：3)；

fip：cctcgtcctgtttgtccttcatttgtttcaaggccctgaggtgtgt(seqidno：4)

bip：gaggcttaaggaggaggaagaagacactttgtcctcatcatcctccgac(seqidno：5)；

lf：tgcctgcaggcagagc(seqidno：6)；

lb：gaggaggcagaggacaat(seqidno：7)。

(2)靶序列，具体为：

tcctggtcctgatgtcgggggcgggcagggctggcagggggcaaggccctgaggtgtgtgctctgcctgcaggcagcagagaaacaaatgaaggacaaacaggacgaggagcagaggcttaaggaggaggaagaagacaagaaacgcaaagaggaggaggaggcagaggacaattgtcggaggatgatgaggacaaagatgaggatgaggaggatgaggag(221bp)(seqidno：1)。

实施例2

本实施例为本发明检测calr基因2型突变的试剂盒及其方法。

本发明所采用的试剂盒包括扩增反应体系，该扩增反应体系的总体积为25μl，其包括2×反应缓冲液(rm)12.5μl，引物f3：0.5μl(终浓度0.2μmol/l)，引物b3：0.5μl(终浓度0.2μmol/l)，引物fip：0.5μl(终浓度0.8μmol/l)，引物bip：1μl(终浓度1.6μmol/l)，引物lf：1μl(终浓度0.8μmol/l)，引物lb：1μl(终浓度0.8μmol/l)，bstdna聚合酶1μl(8u)，钙黄绿素(fd)1μl，去离子水4.0μl，dna模板2μl。

采用上述试剂盒进行lamp反应，lamp反应条件为：65℃，60min；所用的设备为普通pcr仪或恒温金属浴等能够稳定提供65℃恒温的设备；然后进行可视化判读来鉴定样本是否为calr基因2型突变阳性，具体为结果判断：反应结束后，反应液的颜色由原来的淡黄色变为绿色，即判定为反应阳性。

构建含靶序列的ta克隆质粒，制备梯度浓度的双份样本，具体浓度为10¹copies/ml，10²copies/ml，10³copies/ml，10⁴copies/ml，10⁵copies/ml，10⁶copies/ml，10⁷copies/ml，10⁸copies/ml，用所建立的calr基因2型突变lamp反应体系进行检测，均能检出；对临床calr基因2型突变患者全血样本的基因组dna和构建的重组质粒能特异性的检出，对calr基因1型突变患者全血样本的基因组dna和构建的重组质粒或正常人的野生型基因组dna和构建的重组质粒均无非特异性的扩增，检测效果良好，详见图1。

转入了calr-2型突变质粒的293t细胞、转入了野生型质粒的293t细胞，均为10⁶个细胞，用基因组dna抽提试剂盒抽提dna，然后按比例稀释，制成梯度突变负荷浓度的样本，用所建立的lamp反应体系进行扩增，发现突变负荷检出敏感性可达到3％，略低于探针法实时pcr的效果。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

sequencelisting

<110>复旦大学附属华山医院；复旦大学

；上海速创诊断产品有限公司

<120>一种检测calr基因2型突变的引物组合物及其试剂盒

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>221

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>靶序列

<400>1

tcctggtcctgatgtcgggggcgggcagggctggcagggggcaaggccctgaggtgtgtg60

ctctgcctgcaggcagcagagaaacaaatgaaggacaaacaggacgaggagcagaggctt120

aaggaggaggaagaagacaagaaacgcaaagaggaggaggaggcagaggacaattgtcgg180

aggatgatgaggacaaagatgaggatgaggaggatgaggag221

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>扩增引物f3

<400>2

tcctggtcctgatgtcgg18

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>扩增引物b3

<400>3

ctcctcatcctcctcatcct20

<210>4

<211>46

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>扩增引物fip

<400>4

cctcgtcctgtttgtccttcatttgtttcaaggccctgaggtgtgt46

<210>5

<211>49

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>扩增引物bip

<400>5

gaggcttaaggaggaggaagaagacactttgtcctcatcatcctccgac49

<210>6

<211>16

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>扩增引物lf

<400>6

tgcctgcaggcagagc16

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>扩增引物lb

<400>7

gaggaggcagaggacaat18