一种藤黄微球菌株及其用途的制作方法

本发明属于微生物学技术领域，具体来说涉及一种藤黄微球菌，同时还涉及该菌株在解离释放高硫煤矸石中磷方面的用途。

背景技术：

以煤炭为主要能源的国家，大多煤炭资源丰富、品种齐全、分布广泛，煤炭对经济的发展起到举足轻重的作用。在煤炭开采和加工中，会产生20-25%的煤矸石，目前仅中国废弃的煤矸石就有数十亿吨。根据煤中含量硫的高低，可将煤分为低硫煤和高硫煤，硫含量在煤炭中的变化的幅度很大，最高为8%，最低为0.12%。煤矸石的暴露堆放，经雨水冲淋后，部分有害物质被溶解，并随雨水流进土壤、地表水体或地下水体，造成其严重的污染。被污染的地表水体中的水质会逐渐酸化，当用来养殖或浇灌植物时，会对畜牧业和植被造成不可逆的损害，且破坏水生生态环境。当淋溶水随雨水流进土壤时，打破了土壤中重金属的平衡，也破坏了土壤的养分，并影响土壤中微生物的代谢活动，且这些有害物质的存在，不仅阻碍了植物根系的发育和生长，还会在植物有机体内积蓄，通过食物链危害人体健康。

煤矸石中含有很多丰富的营养元素，有很多事植物生长所必需的。矿物中有一些微生物可以分解矿物，从而解离出其中的元素，由于这些细菌来源于大自然，本身对环境无害，且分解过程和分解产物无害，对环境无污染，是绿色环保的。用微生物细菌分解煤矸石，解离出其中的有效成份，开发煤矸石的新用途，是煤矸石资源化应用的重要途径。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一株能高效分解高硫煤矸石释放磷的藤黄微球菌。

本发明的另一目的在于提供该藤黄微球菌在解离释放高硫煤矸石中磷方面的用途。

本发明的一种藤黄微球菌(micrococcusluteus)gzu-mi01，其形态特征：菌种在lb培养基上的菌落外观形态：金黄色，中凹台状圆形，不透明，边缘整齐，表面光滑湿润，有光泽，菌落大小约为2mm。该菌为革兰氏阳性四联球菌。

该菌株菌于2017年03月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为：cctccno：m2017126，名称：藤黄微球菌gzu-mi01(micrococcusluteusgzu-mi01)。

本发明的藤黄微球菌gzu-mi01的分离，包括以下步骤：

1.分离筛选

1)初筛

采集煤矸石山上的矿样，采用稀释法，而后接种于无机磷固体培养基平板，待长出之后，通过首先观察菌落外观形态，再进行平板划线分离提纯法，最后进行革兰氏染色来初筛菌株。

2)复筛

活化初筛得到的菌株并进行培养，在一定条件下，进行解离高硫煤矸石试验，通过测定解离后煤矸石中的有效磷含量，从而筛选出解磷效果好的菌株。

2.菌株的培养

难溶性无机磷液体培养基：葡萄糖10g，(nh4)so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3，mgso4·7h2o0.3g，feso4·7h2o0.03g，mnso4·h2o0.03g，ca3(po4)210g，蒸馏水1000ml，ph=7.0-7.2。

难溶性无机磷固体培养基：在难溶性无机磷液体培养基中加琼脂15g-20g。

lb液体培养基：蛋白胨5g、氯化钠5g、牛肉膏1g、酵母膏2g、ph=7.4，蒸馏水1l。

lb固体培养基：在液体lb液体培养基中加琼脂15g-20g。

3.三种保种方式

1）将需要保存的菌株，划线于lb固体培养基平板上或斜面试管中，30℃培养18-24h，置于4℃冰箱中，保存一个月。

2）将在平板上已长好的菌株用灭菌的20%的甘油液体培养基冲洗，而后保存于-20℃的冰箱中，可保存一年。

3）将在平板上已生长良好的菌株，加入30%的脱脂奶，混匀后倾倒入无菌安瓿管中，用无菌脱脂棉塞住管口，放入-20℃冰箱预冻3-4h，再抽真空，熔封管口，放入-80℃的冰箱中保存，该方法可长期保存。

4.gzu-mi01菌株的生长曲线

在适宜的培养条件下，细菌的生长繁殖将经历延迟期，对数期，稳定期和衰亡期。采用分光光度法测定细菌的生长曲线，以培养时间为横坐标，以菌体生长速率或菌数的对数为纵坐标绘制生长曲线。通过测定生长曲线，可以得知细菌在不同时间段的生长情况。

5.gzu-mi01菌株的分子生物学鉴定

通过对菌株进行16srrna克隆，然后测序，再将该序列与ncbi细菌库进行比对，找出与它同源性最近的属，并通过一系列生化实验，最终确定该株菌的种。

本发明的另一目的在于提供该藤黄微球菌在解离释放高硫煤矸石中磷方面的用途。

本发明与现有技术相比,具有明显的有益效果,从以上技术方案可知:从废弃的煤矸石样品中分离，筛选，提纯，获得高效分解煤矸石中磷的菌株，本发明具有很好的应用前景。用细菌处理废弃的煤矸石，是一种平和的、绿色化工艺，能有效地缓解煤矸石对环境带来的危害，还可以让煤矸石变废为宝，充分利用其中的有效资源。如果将煤矸石制备成复合肥料施于土壤，不仅可以缓解土壤中缺磷的问题，而且还可以避免使用化肥带来的环境问题，比如土壤板结。与目前应用化学方法处理煤矸石相比，对环境更友好。

附图说明

图1.gzu-mi01菌株生长曲线

图2.gzu-mi01菌株菌落外观图

图3.gzu-mi01菌体形态图

图4.pcr扩增反应体系和扩增反应条件

图5.gzu-mi01菌株基于部分16srrna基因序列建立的系统进化树

图6.几种细菌高硫煤矸石解离结果

具体实施方式

藤黄微球菌gzu-mi01的分离，包括以下步骤：

1.功能菌株gzu-mi01菌株的分离与筛选

1）样品采集

（1）样品采自于某含硫煤矸石山上已风化煤矸石，然后将采集的样品装入塑料样品采集袋中。

（2）将采集的样品破碎。

（3）筛分，收集过100目的样品。

（4）将样品放入4℃的冰箱备用。

2）功能菌株的筛选

（1）准确称取1g样品于灭菌的250ml的锥形瓶中，加入99ml无菌水。

（2）然后在170r/min，37℃左右的摇床中振荡30min。

（3）对照组是加入100ml无菌水于250ml的锥形瓶中。

（4）半个小时以后，取上清液逐级稀释至10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7。

（5）每种浓度分别取100ul涂布于3个无机磷固体培养基上，空白为涂布无菌水的平板。

（6）将平板放于30℃左右的恒温培养箱中3-4天。

（7）将外观特征不同的单菌落划线接种于无机磷固体培养上。

（8）待长出后，通过初步外观形态观察以及显微形态观察，观察菌株是否纯化，没有纯化则多进行几次，直到成为单一菌株，同时区别出不同的菌株。

（9）将纯化的菌株，进行革兰氏染色。

（10）对纯化的初筛的细菌进行培养，在将其处理高硫煤矸石，通过测定其中的有效磷含量，含量越高则细菌的分解效果越好，从而筛选出解磷效果好的菌株。

2.功能菌株的生长曲线的绘制

1）种子液的制备。取该菌株一接种环接种于lb液体培养基中，在30℃条件下，培养至对数期。

2）接种。取上述种子液的10ml接种于装有200ml的液体lb培养基中，混匀后分别取5ml混合液分别装于上有标记的18支无菌试管中。

3）培养。将已接种的试管置37℃，170r/min的摇床中培养，分别培养相应的时间取出。

4）测量。用未接种的lb液体培养基做空白，在600nm波长下与待测样一起进行光电比浊。

测定结果如图1，从图中可知，0-10h为延滞期，10-28h为对数期，28h-38h为稳定期，38h以后为衰亡期。

3.功能菌株的鉴定

1）菌落外观形态

如图2，从图中可知该菌株在lb固体培养基上呈现金黄色，中凹台状圆形，不透明，边缘整齐，表面光滑湿润，有光泽，菌落大小约为2mm。

2）革兰氏染色，菌体显微形态

如图3，从图中可知该菌株为革兰氏阳性四联球菌。

3）菌株鉴定

（1）细菌dna的提取

挑取纯化的菌株的单菌落至装有lb液体培养基的锥形瓶中进行培养，得到纯菌种发酵液后，以细菌基因组提取试剂盒(离心柱型，天根生化科技北京有限公司)提取dna，以其作为模版进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)，使用taqdna聚合物扩增16srrna，用2f(5′-agagtttgatcctggctcaggatga-3′)，1492r(5′-tacggctacct

tgttacgacttagc-3′)的通用引物进行扩增，pcr扩增反应体系和扩增反应条件如图4所示。

以1×tbe缓冲液配制1.0%琼脂糖凝胶，加入40µlpcr扩增产物，加8µl2000bpdnamarker，在电压110v，电流70ma，电泳45min，观察凝胶成像结果。

（2）同源性比对

将聚合酶链式反应扩增产物经凝胶回收试剂盒纯化，送交测序公司(上海立菲生物技术有限公司)测序，将测得的序列在ncbi(美国国立生物技术信息中心)上利用standardnucleotideblast进行比对，并利用clustalw、mega5.05等软件基于邻接法(neighborjoiningmethod)进行系统发育分析，构建系统发育树（图5），以获得菌种的分类信息。从图中可知，gzu-mi01的细菌与micrococcussp.japan-tut1210(ab188213.1)聚在同一个分支上，序列同源性达99%，gzu-mi01鉴定为微球菌属(micrococcussp.)。

（3）生理生化实验

通过一系列生化实验，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版）和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠等，1999），经鉴定该菌株为藤黄微球菌。

4.菌株对高硫煤矸石的解离能力的测定

采用同一来源高硫煤矸石，作gzu-mi01菌株与两株传统菌株—巨大芽孢杆菌和硅酸盐细菌对比解离试验，比较它们的解磷效果。首先在影响煤矸石解离的四个主要因素：粒径大小，体系ph值，解菌量和体系的培养时间，作单因素试验，分别寻找最佳条件，再通过设计正交实验寻找gzu-mi01、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌在最佳解离煤矸石条件，并比较对高硫煤矸石的解离效果，结果如图6。

从图6中可以看出，gzu-mi01解离高硫煤矸石的效果明显于巨大芽孢杆菌和硅酸盐细菌。

序列表

<110>贵州大学

<120>一种可以解离释放高硫煤矸石中磷的菌株

<130>1

<160>1

<170>patentlnversion3.3

<210>1

<211>1400

<212>dna

<213>藤黄微球菌（micrococcusluteus）

<400>1

catgcaagtcgaacgatgaagcccagcttgctgggtggattagtggcgaacgggtgagta60

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