本发明涉及异丁香酚单加氧酶的基因工程菌的构建及其生物催化技术领域，尤其涉及一种异丁香酚单加氧酶活性聚集体的构建方法及转化异丁香酚生产香草醛的方法。
背景技术：
香草醛是世界上需求量最大的香料之一，广泛应用于食品、饮料、药品、化妆品等行业。目前市面上销售的香草醛分为天然香草醛和化学合成香草醛两种。其中，化学合成香草醛占市场份额的90％以上。研究发现，大剂量食用化学合成香草醛会造成头晕、呕吐、甚至损伤内脏。天然的香草醛提取自植物香荚兰的豆荚，因香荚兰的种植受到气候、产地、地方政策等的影响，每年产量不足20t，远不能满足人们的需求，且价格较为昂贵，每公斤价格是化学合成香草醛的几十倍。通过生物转化法获得的香草醛属于天然香草醛，其香味与天然香草醛无异，具有周期短、生产成本低等优点，是最具有发展前途的替代方法之一。异丁香酚来源广泛、价格低廉，是微生物转化法获得香草醛的理想前体物质。异丁香酚单加氧酶是高效催化异丁香酚获得香草醛的唯一关键酶。
生物催化生产香草醛需要解决的关键难题之一是如何高效制备异丁香酚单加氧酶。酶催化技术的核心是酶的高效生产、分离、制剂化和应用开发，但目前酶制剂的生产过程复杂、成本很高，已成为制约酶催化广泛应用的关键问题。近年来，人们发现通过将某些具有两亲性自组装功能的短肽(self-assemblypeptides，saps，一般在8-18个氨基酸残基)连接于可溶性酶的末端可以有效地诱导活性酶聚集体的生成。应用活性酶聚集体结合包埋法或交联酶聚集法(cross-linkedenzymeaggregates，clea)制备固定化酶具有操作简单、活性高等优势，能够显著的降低蛋白质固定化成本，简化工艺，后续还可成功应用于目的蛋白的初步纯化，是实现活性酶制备工业放大和高通量纯化的基础目前，尚未有构建出异丁香酚单加氧酶活性聚集体的任何公开及报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于，提供一种异丁香酚单加氧酶活性聚集体的构建方法及转化异丁香酚生产香草醛的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种构建异丁香酚单加氧酶活性聚集体及其固定化的方法，包括以下步骤：
s1、构建用于生产异丁香酚单加氧酶活性聚集体的重组大肠杆菌：
将具有两亲性自组装功能的短肽18a(ewlkafyekvleklkelf)与目标基因异丁香酚单加氧酶连接，构建异丁香酚单加氧酶-18a活性聚集体，并在大肠杆菌中表达，获得重组大肠杆菌；
s2、使用构建的所述重组大肠杆菌生产异丁香酚单加氧酶活性聚集体：
将构建的所述重组大肠杆菌进行培养优化、诱导，离心收集诱导后的菌体，破碎细胞以获得粗酶液，将所得粗酶液离心和/或过滤，得到沉淀即为异丁香酚单加氧酶活性聚集体。
优选地，步骤s1包括以下步骤：
s1-1、将菌株e.colibl21(de3)iem和e.colibl21(de3)pet30a-lipa-18a进行培养，分别获得大肠杆菌e.colibl21(de3)iem和大肠杆菌e.colibl21(de3)pet30a-lipa-18a；
s1-2、根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计四对pcr引物，包括上游引物a、下游引物b1、下游引物b2、下游引物b3和下游引物b4；其中上游引物a和下游引物b4为包含酶切位点的特异性引物；
s1-3、按照顺序分别使用四对pcr引物，以大肠杆菌e.colibl21(de3)iem为第一次pcr模板进行pcr扩增，得到的pcr产物稀释1000倍后取1μl作为下一次pcr的模板；下一次的pcr均以上一次pcr产物为模板进行扩增，最终得到pcr产物目的基因异丁香酚单加氧酶，命名为iem-1；
s1-4、对所述目的基因iem-1进行纯化；
s1-5、从大肠杆菌e.colibl21(de3)pet30a-lipa-18a中提取质粒pet30a-lipa-18a；
s1-6、分别对所述目的基因iem-1与质粒pet30a-lipa-18a进行双酶切；
s1-7、将目的基因iem-1和质粒pet30a-lipa-18a的双酶切产物进行核酸电泳，回收双酶切产物；
s1-8、将目的基因iem-1和质粒pet30a-lipa-18a双酶切再回收后的产物进行连接，得到连接产物异丁香酚单加氧酶-18a活性聚集体，命名为pet30a-iem-18a；
s1-9、用所述连接产物pet30a-iem-18a转化大肠杆菌e.colibl21(de3)，得到重组菌e.colibl21(de3)pet30a-iem-18a。
优选地，步骤s1-2中：
上游引物a的序列如下：5’-tagctacatatgatggcaacgtttaccgcaatgatc-3’
下游引物b1的序列如下：5’-gcggccgccttatctctcgaggttcttagactgccaac-3’
下游引物b2的序列如下：5’-gtgcaacgctgctcggagacggaagggtagctt-3’
下游引物b3的序列如下：5’-gactgccaacaaccgtgcaacgctgctcggaga-3’
下游引物b4的序列如下：5’-tagctaaagctttcagttcttagactgccaacaaccgtgc-3’。
优选地，步骤s2包括以下步骤：
s2-1、将构建的所述重组大肠杆菌接种于含卡纳霉素的液态lb培养基中培养以获得种子液；
s2-2、取获得的种子液接种于含卡纳霉素的固态lb培养基中培养；
s2-3、在所述固态lb培养基中加入诱导剂(iptg)进行诱导；
s2-4、低温高速离心收集诱导后的菌体，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液重悬菌体，配成细胞悬液，破碎细胞；
s2-5、离心，在沉淀物中加入等体积的甘氨酸-氢氧化钠或碳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液，轻柔重悬(用移液枪吸打2-3次)，获得的粗酶液，离心和/或过滤，得到沉淀即为异丁香酚单加氧酶活性聚集体。
优选地，该构建方法还包括以下步骤：
s3、异丁香酚单加氧酶活性聚集体的固定化：
通过交联酶聚集体技术，采用戊二醛为交联剂，将步骤s2获得的异丁香酚单加氧酶活性聚集体进行无载体固定化。
优选地，步骤s3包括以下步骤：
s3-1、在低温下往步骤s2获得的粗酶液中滴加戊二醛溶液(浓度100mmol/l；交联时间为60–240分钟)，搅拌；
s3-2、在低温下高速离心，获得的沉淀物为固定化的异丁香酚单加氧酶活性聚集体，即固定化酶；
s3-3、通过碳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液对固定化酶重悬，清洗固定化酶表面附着的戊二醛；
s3-4、低温高速离心，采用碳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液重悬固定化酶。
本发明还提供一种异丁香酚单加氧酶活性聚集体转化异丁香酚生产香草醛的方法，包括以下步骤：
t1、构建用于生产异丁香酚单加氧酶活性聚集体的重组大肠杆菌：
将具有两亲性自组装功能的短肽18a(ewlkafyekvleklkelf)与目标基因异丁香酚单加氧酶连接，构建异丁香酚单加氧酶-18a活性聚集体，并在大肠杆菌中表达，获得重组大肠杆菌；
t2、使用构建的所述重组大肠杆菌转化异丁香酚生产香草醛：
将构建的所述重组大肠杆菌进行培养优化、诱导，离心收集诱导后的菌体，重悬菌体配成细胞悬液，加入异丁香酚进行转化，获得含有香草醛的反应液。
优选地，步骤s1包括以下步骤：
t1-1、将菌株e.colibl21(de3)iem和e.colibl21(de3)pet30a-lipa-18a进行培养，分别获得大肠杆菌e.colibl21(de3)iem和大肠杆菌e.colibl21(de3)pet30a-lipa-18a细胞；
t1-2、根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计四对pcr引物，包括上游引物a、下游引物b1、下游引物b2、下游引物b3和下游引物b4；其中上游引物a和下游引物b4为包含酶切位点的特异性引物；
t1-3、按照顺序分别使用四对pcr引物，以大肠杆菌e.colibl21(de3)iem为第一次pcr模板进行pcr扩增，得到的pcr产物稀释1000倍后取1μl作为下一次pcr的模板；下一次的pcr均以上一次pcr产物为模板进行扩增，最终得到pcr产物目的基因异丁香酚单加氧酶，命名为iem-1；
t1-4、对所述目的基因iem-1进行纯化；
t1-5、从大肠杆菌e.colibl21(de3)pet30a-lipa-18a中提取质粒pet30a-lipa-18a；
t1-6、分别对所述目的基因iem-1与质粒pet30a-lipa-18a进行双酶切；
t1-7、将目的基因iem-1和质粒pet30a-lipa-18a的双酶切产物进行核酸电泳，回收双酶切产物；
t1-8、将目的基因iem-1和质粒pet30a-lipa-18a双酶切再回收后的产物进行连接，得到连接产物异丁香酚单加氧酶-18a活性聚集体，命名为pet30a-iem-18a；
t1-9、用所述连接产物pet30a-iem-18a转入大肠杆菌e.colibl21(de3)，得到重组菌e.colibl21(de3)pet30a-iem-18a。
优选地，步骤t1-2中：
上游引物a的序列如下：5’-tagctacatatgatggcaacgtttaccgcaatgatc-3’
下游引物b1的序列如下：5’-gcggccgccttatctctcgaggttcttagactgccaac-3’
下游引物b2的序列如下：5’-gtgcaacgctgctcggagacggaagggtagctt-3’
下游引物b3的序列如下：5’-gactgccaacaaccgtgcaacgctgctcggaga-3’
下游引物b4的序列如下：5’-tagctaaagctttcagttcttagactgccaacaaccgtgc-3’。
优选地，步骤t2包括以下步骤：
t2-1、将构建的所述重组大肠杆菌接种于含卡纳霉素的种子培养基中培养以获得种子液；
t2-2、获得的种子液接种于含卡纳霉素的发酵培养基中培养；
t2-3、在所述发酵培养基中加入诱导剂(iptg)进行诱导；
t2-4、将诱导后的发酵液低温离心，收集菌体，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液重悬菌体，配成细胞悬液；
t2-5、取细胞悬液，加入异丁香酚进行转化，获得含有香草醛的反应液。
本发明的有益效果：将异丁香酚单加氧酶基因与具有自组装功能的两亲性短肽18a构建出异丁香酚单加氧酶活性聚集体，离心、破碎得到聚集体，无需繁琐的纯化步骤。通过无载体固定化的异丁香酚单加氧酶可直接用于转化异丁香酚生产香草醛，减少酶纯化步骤，节约生产成本，实现香草醛的高效生产，便于工业生产应用。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为是从常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明的异丁香酚单加氧酶活性聚集体的构建方法，步骤包括如下：
一、重组菌的构建：构建用于生产异丁香酚单加氧酶活性聚集体的重组大肠杆菌
其中，菌株：由深圳大学保藏的e.colibl21(de3)iem(保藏编号为cgmccno.8918)和e.colibl21(de3)pet30a-iem-18a；大肠杆菌e.colibl21(de3)购于生工生物工程(上海)有限公司。e.colibl21(de3)pet30a-iem-18a属于大肠埃希氏菌(escherichiacoli)，于2016年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.13493。
常用溶液及培养基的制备：
(1)氨苄青霉素(100mg/ml):称取5g氨苄青霉素，用无菌水溶解，定容于50ml容量瓶，用一次性过滤器过滤，分装于1.5mlep管，-40℃保存。
(2)卡纳霉素(50mg/ml):称取2.5g卡纳霉素，用无菌水溶解，定容于50ml容量瓶，用一次性过滤器过滤，分装于1.5mlep管，-40℃保存。
(3)iptg(异丙基硫代半乳糖苷，0.8mol/l)：称取0.2giptg，用无菌水溶解，定容于10ml容量瓶，，用一次性过滤器过滤，分装于1.5mlep管，-40℃保存。
(4)核酸电泳缓冲溶液(1×tae)：将50×tae储存液用超纯水稀释50倍，常温下保存待用。
(5)1％琼脂糖凝胶配制：称取0.25g琼脂糖溶于25ml1×tae，微波炉加热1min至胶溶解均匀，室温下冷却至不烫手，加入3μl核酸染料，混匀，倒入制胶板，室温下冷却备用(所用琼脂糖购自于北京全式金生物技术有限公司)。
(6)0.1mol/lcacl2：制备0.1mol/lcacl2溶液，用一次性过滤器过滤，分装于1.5mlep管，-20℃保存。
(7)蛋白质电泳内液的配制(1*sds-page电泳缓冲液)：将5*sds-page电泳缓冲液用去离子水稀释成1*sds-page电泳缓冲液即可使用。
(8)50％甘油：甘油与无菌水1:1混合，121℃高压灭菌20min，室温保存备用。
(9)液态lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，用5mol/lnaoh调节该培养基至ph7.0；121℃高压灭菌20min。
(10)固态lb培养基配制方法：
①配制：100mllb培养基中加入2g琼脂粉，加热溶解后121℃高压灭菌20min。
②加入抗生素：固体培养基高压灭菌后，将培养基置于无菌操作台内，待培养基冷却至不烫手时加入抗生素，混匀倒平板，每个平板倒入15-20ml固体培养基。
③保存：用封口膜将平板密封，倒置，储存于4℃冰箱。
④抗生素浓度：培养基中的氨苄青霉素终浓度为100μg/ml，卡纳霉素终浓度为50μg/ml。
1、菌株e.colibl21(de3)iem和e.colibl21(de3)pet30a-lipa-18a的培养：
(1)用枪头沾取少量e.colibl21(de3)iem接种于5ml液态lb培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)，于37℃、200rpm下过夜培养。
(2)用枪头沾取少量e.colibl21(de3)pet30a-lipa-18a接种于5ml固体lb培养基(含50μg/ml卡纳霉素)，于37℃、200rpm下过夜培养。
2、根据设计，需要通过pcr在异丁香酚单加氧酶(iem)基因两端引入ndeⅰ和hindⅲ两个酶切位点，由于iem基因内含有一个hindⅲ酶切位点，因此，在不改变其编码的氨基酸的条件下，突变iem内hindⅲ的某个碱基，即定点突变。根据iem基因序列，设计了四对pcr引物，包括上游引物a、下游引物b1、下游引物b2、下游引物b3和下游引物b4；上游引物a和下游引物b4为包含酶切位点的特异性引物。
其中，上游引物a的序列如下：5’-tagctacatatgatggcaacgtttaccgcaatgatc-3’；
下游引物b1的序列如下：5’-gcggccgccttatctctcgaggttcttagactgccaac-3’；
下游引物b2的序列如下：5’-gtgcaacgctgctcggagacggaagggtagctt-3’；
下游引物b3的序列如下：5’-gactgccaacaaccgtgcaacgctgctcggaga-3’；
下游引物b4的序列如下：5’-tagctaaagctttcagttcttagactgccaacaaccgtgc-3’。
3、按照顺序分别使用上述四对引物，以培养获得的大肠杆菌e.colibl21(de3)iem为第一次pcr模板进行pcr扩增，得到的pcr产物稀释1000倍后取1μl作为下一次pcr的模板，以后下一次的pcr均以上一次pcr产物为模板进行扩增。最终得到的扩增序列(pcr产物目的基因异丁香酚单加氧酶)命名为iem-1。
其中，pcr反应体系为：体系总量为25μl，其中上下游引物(浓度均为100μmol/l)各加入0.75μl，模板1μl，2×pfu聚合酶12.5μl，最后加灭菌水10μl补齐。加样原则为：先加入量少的试剂，再加入量大的试剂，目的在于冲匀体系中的分子试剂；模板和聚合酶最后加入，整个过程保持在冰上操作，减少温度过高对酶的损害(所用聚合酶primestarmaxdnapolymerase购自于takara公司)。
pcr反应条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸10s，72℃继续延伸10min，最后降为4℃，即可取出。四次pcr均为此反应条件。
四次pcr结束后将最后一次的pcr产物用琼脂糖凝胶电泳对其进行分析(所用核酸分子量supermarker、loadingbuffer购自于北京康为世纪科技有限公司)，并用凝胶成像系统观察胶图，结果显示通过pcr得到的定点突变iem分子量大小在1.5kb左右，第四步得到的pcr产物经过琼脂糖电泳验证后为一条亮的单带。
4、用dna片段纯化试剂盒(购自于takara公司)对pcr产物目的基因iem-1进行纯化。
用小量质粒提取试剂盒(购自于上海生物工程科技有限公司)从大肠杆菌e.colibl21(de3)pet30a-lipa-18a中提取质粒pet30a-lipa-18a。
5、纯化后的产物(目的基因iem-1)与提取出来的载体质粒pet30a-lipa-18a分别用ndeⅰ和hindⅲ两种限制性内切酶(购自于北京neb有限公司)进行双酶切。
双酶切总体系为50μl：ndeⅰ1μl，hindⅲ1μl，dna或质粒1μl，10xnebuffer5μl，灭菌水补齐至50μl。酶切条件：双酶切过夜，酶切温度37℃。
6、将目的基因iem-1和质粒pet30a-lipa-18a的双酶切产物进行核酸电泳，用dna胶回收试剂盒(购自于takara公司)回收双酶切产物。
7、将目的基因iem-1和质粒pet30a-lipa-18a双酶切再回收后的产物进行连接，将得到的连接产物异丁香酚单加氧酶-18a活性聚集体，命名为pet30a-iem-18a。
连接总体系为20μl：目的基因iem-11μl，质粒pet30a-lipa-18a8μl，10xbuffer2μl，t4dna连接酶(购自于北京neb有限公司)1μl，灭菌水8μl。目的基因iem-1与质粒pet30a-lipa-18a的摩尔比约为3:1，载体和目的片段的总质量在0.01μg左右。连接条件为16℃，4h，4℃过夜。
8、用连接产物pet30a-iem-18a转化e.colibl21(de3)感受态细胞，得到重组菌e.colibl21(de3)pet30a-iem-18a。
9、通过菌落pcr和重组质粒双酶切对重组菌进行验证，并选取阳性克隆子进行基因测序。
e.colibl21(de3)pet30a-iem-18a测序结果：
二、使用构建的重组菌生产异丁香酚单加氧酶活性聚集体
常用溶液及培养基的制备，参考上述重组菌的构建中的溶液及培养基的制备。
1、取50μle.colidl21(de3)pet30a-iem-18a接种于50ml液态lb培养基(含100μg/ml卡纳霉素)，于37℃、200rpm下过夜培养，即得种子液。
2、取1ml步骤1的种子液接种于100ml含100μg/ml卡纳霉素的固体lb培养基，于37℃、200rpm下培养至od600为0.8，加入0.8mmol/iptg，25℃，200rpm，诱导16h。
3、10000rpm低温(4℃以下)离心收集诱导后菌体，用0.05mol/lph10.5甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液重悬菌体，配成60g/l的细胞悬液(菌悬液)，用高压均质机破碎细胞，设置压力800bar，40ml菌悬液破碎三分钟。
4、7000rpm离心5min，上清另存，在沉淀物中加入等体积的0.05mol/lph10.5甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，轻柔重悬(用移液枪吸打2-3次)，将所得粗酶液离心和/或过滤，得到沉淀即为异丁香酚单加氧酶活性聚集体。
三、异丁香酚单加氧酶活性聚集体的固定化
其中，培养基的制备：
种子培养基(g/l)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、nacl10；ph7.0，装液量200ml/500ml锥形瓶。
发酵培养基(g/l)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、nacl10；ph7.0，装液量400ml/1000ml锥形瓶。
1、细胞培养
种子培养：无菌条件下，在种子培养基(含50μg/ml卡纳霉素)中加入200μle.colibl21(de3)pet30a-iem-18a，于37℃、200rpm下振摇过夜培养，获得种子液。
发酵培养：无菌条件下，取80ml种子液接种于发酵培养基(含50μg/ml卡纳霉素)中，于37℃、200rpm下振摇培养至od600为0.8时，加入0.8mmol/liptg，30℃诱导8h。
2、制备固定化酶(固定化的异丁香酚单加氧酶活性聚集体)
诱导结束后，将菌液于低温(4℃以下)下10000rpm离心15min，收集湿菌体，加入0.05mol/lph10.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液配成65g/l的细胞悬液，用均质机高压破碎细胞悬液，设置均质机压强为800bar，40ml细胞悬液循环3min。
破碎结束后收集菌液。4℃下，10000rpm高速离心15min，弃去上清液，在沉淀中加入10ml0.05mol/lph10.5碳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液，轻柔重悬沉淀，所得粗酶液即为异丁香酚单加氧酶活性聚集体。
将重悬完全的粗酶液于低温下(4℃以下)缓慢滴加121μl50％戊二醛溶液，滴加同时保持磁力搅拌不间断，搅拌期间保持低温，以防高温引起酶失活。搅拌2h后取出溶液；4℃下，10000rpm高速离心15min，弃去上清，取20ml0.05mol/lph10.5碳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液重悬两次，清洗固定化酶表面附着的戊二醛等；低温(4℃以下)高速(10000rpm)离心弃去上清，制备出异丁香酚单加氧酶固定化酶。
四、使用异丁香酚单加氧酶活性聚集体转化异丁香酚生产香草醛
实施例1
从-80℃保藏的甘油管e.colibl21(de3)pet30a-iem-18a取出50μl，按照上述种子培养的培养方法培养过夜，取1ml种子液接种于含50μg/ml卡纳霉素的发酵培养基，当od600为0.8时，加入0.8mmol/liptg，诱导温度为30℃，200rpm，诱导16h；将诱导后的发酵液10000rpm低温(4℃以下)离心15min，弃去上清，收集菌体，用0.05mol/lph10.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液重悬菌体，配成80g/l的细胞悬液。
取10ml菌体(细胞悬液)，加入260mmol/l异丁香酚，于25℃、200rpm下转化48h，测定最终反应液中香草醛的浓度为2.24g/l。
实施例2
从-80℃保藏的甘油管e.colibl21(de3)pet30a-iem-18a取出50μl，按照上述种子培养的培养方法培养14h，取1ml种子液接种于含50μg/ml卡纳霉素的发酵培养基，当od600为0.8时，加入0.8mmol/liptg，30℃诱导，200rpm，诱导时间为8h，将诱导后的发酵液10000rpm低温(4℃以下)离心15min，弃去上清，收集菌体；用0.05mol/lph10.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液重悬菌体，高压破碎细胞悬液，收集沉淀，加入10ml0.05mol/lph10.5碳酸钠-氢氧化钠缓冲溶液，轻柔重悬，于低温下(4℃以下)缓慢滴加121μl50％戊二醛溶液，保持磁力搅拌2h后离心取沉淀，制备出异丁香酚单加氧酶固定化酶。
取9ml含固定化酶的溶液，加入1mldmso，100mmol/l的异丁香酚，25℃，200rpm，转化36h，反应结束后离心反应液，弃去上清，用缓冲溶液清洗交联酶两次，再用9ml0.05mol/lph10.5甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液重悬交联酶，继续下一次的酶催化反应，反复使用交联酶，测定每次反应液中香草醛的浓度；结果表明其具备良好的操作稳定性，重复使用7次后酶活保留在60％以上。
香草醛的测定方法：
以高效液相色谱法(hplc)测定香草醛和异丁香酚。
样品处理：反应液加入与反应液同体积的乙醇，沉淀蛋白(异丁香酚单加氧酶活性聚集体)，并溶解底物(异丁香酚)和产物(香草醛)，10000r/min离心5min，再以乙醇稀释10-20倍(实施例中稀释10倍)，滤膜过滤，待测。
色谱柱：thermobdshypersilc18反相色谱柱250×4.6mm；
流动相：a＝0.01％冰醋酸水溶液，b＝甲醇；
梯度洗脱程序：开始时35％b，保持7分钟，到15min时增加至70％b，到17min时降至35％b；
柱温：30℃；
流速1ml/min，波长280nm处紫外检测，进样量20μl。其中香草醛和异丁香酚的出峰时间分别为7.8min和17.4min左右。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
<110>深圳大学
<120>异丁香酚单加氧酶活性聚集体的构建方法及转化异丁香酚生产香草醛的方法
<130>cn1618492yz
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