一种检测鸭源性成分的RPA引物、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于畜产品安全生物技术领域，具体涉及一种检测鸭源性成分的rpa引物、试剂盒及检测方法。

背景技术：

民以食为天，食以安为先，食品是人类社会赖以生存的第一物质基础。随着人民生活水平的提高，动物源性食品的消费量在逐年增加。食源性疾病和肉食品的潜在危险性不论在发达国家还是发展中国家都没有得到有效控制，畜禽类肉食品的质量与安全问题已经成为一个全球性的问题。

从核酸分子水平上对动物进行物种鉴定、物种起源和多样性评估以及对动物源性食品进行检验研究，是目前动物源性成分研究的最有效手段。目前已颁布的标准只有3项地方标准是关于鸭源性成分的检测，主要采用的是常规定性pcr法和实时荧光pcr法对鸭动物源性的定性检测。

其中，基于常规pcr-凝胶电泳法的鸭动物成分定性分析标准有地方标准dbs22/018-2013(畜肉中鸭源性成分)和db22/t2049-2014(鸭源性成分)，基于实时荧光pcr法的动物成分定性分析标准有地方标准db64/t965-2014(鸡、鸭源性成分)，但是，目前常规pcr和荧光pcr检测方法存在操作繁琐、成本高、单一性等问题。

在畜产品动物源性成分检测中，迫切需要建立快速简便的核酸检测方法，用于市场监管和例行监测。与常规pcr和荧光实时pcr定性检测方法相比，利用聚合酶重组酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)对动物源性肉及肉制品进行定性高通量检测，其模仿体内复制机理，反应不需要反复升降温的解链与退火过程，整个反应简单快速，能够在15分钟内进行常温下的快速目标靶基因的核酸检测。

rpa方法的关键在于扩增引物的设计。pcr引物多半是不适用的，这是因为，rpa引物比一般pcr引物长，通常需要达到30-38个碱基，引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。因此，rpa的引物设计难度较大。

目前，已报到的鸭源性成分检测方法中，主要是利用pcr仪在实验室中进行常规的检测，这些方法还不能进一步满足畜产品的快速检测。国内外目前还没有利用rpa技术对鸭源性成分的物种特异性的鉴定。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测鸭源性成分的rpa引物、试剂盒及检测方法，能准确、快速、简便检测被检制品中是否含有鸭源性成分，与现行标准中常规pcr和荧光定量pcr方法比较，具有高度专一性，灵敏度高、扩增速度快、所需时间短、直观性强的特点，实现常温下对动物源性肉及肉制品进行快速简便检测，满足政府对市场监管和例行监测。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

用于检测鸭源性成分的rpa引物，包括正向引物rpa-duck-f和反向引物rpa-duck-r，具体序列如下：

rpa-duck-f：5'-tgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatc-3'；

rpa-duck-r：5'-tctatcgcgtattaaatgtataattgcgggac-3'。

一种用于检测鸭源性成分的rpa检测试剂盒，其包括所述的rpa引物。

进一步，所述rpa检测试剂盒，其包含rpa反应体系，该rpa反应体系中各成分的终浓度为：rpa引物的正、反向引物各为0.4-1μmol/l，且，正、反引物的比例为0.5-2：1，dna模板0.4-1.2ng/μl，ph为6.9-7.1的磷酸缓冲液0.10-0.25m，磷酸镁15-25mmol/l。

一种检测鸭源性成分的rpa方法，包括：

1)提取待测样品的dna作为模板；

2)将所述的rpa引物对加入到rpa扩增反应体系中，进行rpa扩增反应；

3)然后通过琼脂糖凝胶电泳，若得到片段大小为220bp的条带，则证明所检样品中含有鸭源性成分。

进一步，进行rpa扩增反应时，所述rpa反应体系中各成分的终浓度为：rpa引物的正、反向引物各为0.4-1μmol/l，且，正、反引物的比例为0.5-2：1，dna模板0.4-1.2ng/μl，ph为7.05的磷酸缓冲液0.12m，磷酸镁15-25mmol/l。

优选地，所述rpa反应体系总体积为50μl，其中，浓度为10μmol/l的rpa引物的正、反向引物各加入2-5μl，浓度为20ng/μl的dna模板加入1-3μl，浓度为0.2m、ph7.05的磷酸缓冲液29.5μl，浓度为250mmol/l磷酸镁溶液3-5μl，ddh2o补足至50μl。

优选地，所述rpa反应体系中，总体积为50μl，其中，浓度为10μmol/l的rpa引物的正、反向引物各加入2.4μl，浓度为20ng/μl的dna模板加入2μl，浓度为0.2m、ph为7.05的磷酸缓冲液29.5μl，浓度为250mmol/l的磷酸镁溶液4μl，ddh2o补足至50μl。

进一步，所述rpa扩增反应程序为：恒温35-40℃，15～25分钟。

优选地，所述步骤2)中，rpa扩增反应程序为：37℃恒温反应18分钟。

通过查阅文献和用blast软件分析，以鸭总dna作为模板进行筛选，筛选出鸭线粒体上的基因核酸序列(mtdna)，相比于核dna的线性结构，mtdna的环形结构具有不随着时间降解的稳定性，这使得线粒体能在极端的食品加工条件中保存下来。此外，每个细胞的细胞核中只有一份ndna存在，而某一细胞线粒体dna存在多个复制体，这使mtdna试验比ndna检测更敏感。从另一个角度来看，mtdna长度短，并且不同生物间的mtdna差异很大，高等动物的线粒体dna的典型尺寸约16000个碱基对(bp)。同时，不同于ndna，线粒体dna属于完全的母系遗传，没有组蛋白的结合保护，又缺少dna损伤的修复系统，所以极易发生突变，且突变结果容易保存下来，因此，mtdna的突变率为核dna的10倍以上。本发明利用mtdna良好的特异性，将其作为物种检测中的目标序列来源。

本发明根据鸭物种的线粒体特异性序列区域(accession:kj833587.1，gi:675023238)设计大量的rpa特异性引物，引物中个别碱基的增减都会对特异性扩增的效果产生影响，从中筛选出一套可快速有效地检测出鸭源性成分的rpa引物，本发明筛选出的基于鸭线粒体上细胞色素c氧化酶iii基因片段上的rpa引物，扩增时间短，电泳条带明显，灵敏度高。

本发明的rpa引物具有如下特点：(1)rpa引物的长度符合30至35个核苷酸的要求；(2)rpa引物5'端的3-5个核苷酸避免聚鸟嘌呤，gc含量在40％～60％之间，碱基随机分布，并避免重复序列；(3)尽量避免引物内部出现引物间互作、二级结构、发夹结构，减少引物二聚体的形成；(4)鸭源性成分特异性片段为220bp。

基于本发明的rpa引物建立鸭源性成分物种特应性的rpa检测方法,不需要特殊的仪器，无需像常规pcr或荧光pcr方法那样循环变温，适适用范围广，检测时间短，约需15～25分钟，就能快速检测被检制品中是否含有鸭源性成分，检测结果准确可靠，灵敏度高，大大缩短了实验进程，简化了实验步骤，在肉类产品动物源性成分鉴定中的准确性及快速检测方面得到了显著的提高。

与现有技术对比，本发明具有如下有益效果：

1)利用本发明的rpa引物对进行快速检测，以鸭物种基因组dna为模板时，可以得到明显的特异性片段为220bp的电泳条带，而其他物种(羊、牛、鸡和猪等)的基因组dna为模板没有得到电泳条带，证明其具有高度专一性。

2)利用本发明的rpa引物及检测方法，将鸭物种基因组dna模板用ddh2o稀释后，可以检测到50个拷贝的靶基因，证明该方法具有较高的灵敏度，这是现有技术不能达到的灵敏水平。

3)利用本发明的rpa检测方法，使被检制品中鸭源性成分鉴定过程中，提高了准确性，简化了检测步骤，所需检测时间短，使用更加便捷。

附图说明

图1为本发明实施例中鸭动物源性成分特异性检测电泳图谱；其中，m：dl2000marker；1-3：ntc；4-6：鸭；7-9：牛；10-12：羊；12-15：鸡；16-18：猪。

图2为本发明实施例中鸭动物源性成分检测的灵敏度扩增电泳图谱；其中，m：dl2000marker；dna采用鸭基因组dna不同梯度稀释为：1-3：5000copies；4-6：500copies；7-9：50copies。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1获得用于检测鸭源性成分的rpa引物

通过查阅文献和用blast软件分析，以50ng/μl的鸭总dna作为模板进行优化筛选，筛选出鸭线粒体上的基因核酸序列，并进行引物的设计和筛选。

在rpa引物设计时考虑到以下几个要点：(1)rpa引物的长度一般为30至35个核苷酸；(2)rpa引物5'端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤，gc含量在40％～60％之间，碱基随机分布，并避免重复序列；(3)rpa引物设计时尽量避免引物内部出现引物间互作、二级结构、发夹结构，减少引物二聚体的形成。

筛选出的rpa引物具体序列如下：

rpa-duck-f：5'-tgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatc-3'；

rpa-duck-r：5'-tctatcgcgtattaaatgtataattgcgggac-3'。

实施例2一种检测鸭源性成分的物种特应性的rpa检测方法验证

以常见的猪、牛、羊、鸡和鸭等作为对象，进行了扩增反应，并利用试纸条进行了检测，以电泳法为对比进行验证。

1)分别提取待测样品dna(猪、牛、羊、鸡和鸭)；

rpa扩增

将实施例1中的rpa引物利用twistdx公司开发的rpa试剂盒进行聚合酶重组酶等温扩增。

扩增反应体系：总体积为50μl，浓度为10μmol/l的rpa引物的正、反向引物各加入2.4μl，浓度为20ng/μl的dna模板加入2.0μl，煮沸再冷却的纯水配制磷酸缓冲液(0.2m，ph7.05)29.5μl，250mmol/l磷酸镁溶液4μl，ddh2o补足至50μl。

扩增反应程序为：放入pcr仪器或恒温扩增仪37℃反应18分钟。

3)产物检测

将步骤2)的等温扩增产物进行电泳分析，利用本发明rpa引物，对猪、牛、羊、鸡和鸭进行rpa检测，通过琼脂糖凝胶电泳，如果得到明显的特异性条带，片段长度为220bp，则证明所检样品中含有鸭源性成分。

检测鸭动物源性成分的特异性扩增电泳图谱如图1所示，由图1可以看出，本发明的rpa引物能够快速准确地鉴定出鸭动物源性成分，其中在含有鸭动物源性成分的样品中有明显的扩增条带，而牛、羊、鸡和猪等其他物种的样品均没有扩增条带。

利用本发明rpa引物进行鸭动物源性成分的灵敏度扩增验证，将样品用ddh2o分别稀释至50、500、5000个拷贝，进行灵敏度扩增，扩增电泳图谱如图2所示，由图2可以看出，利用该方法可以检测到50个拷贝的鸭动物源性成分特异性分子序列，说明用本发明设计的引物鉴定鸭动物源性成分具有较高的灵敏度和准确性，且操作简单。