一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子文库的方法与流程

本发明属于高通量测序领域，具体而言，本发明涉及一种构建扩增子文库的方法。
背景技术：
：多重pcr靶向捕获测序技术是指，利用多重pcr技术同时对基因组dna上的多个目标区域进行扩增，得到扩增子，然后通过酶连接或者通过pcr方式将二代测序接头添加到扩增子序列的两侧，得到扩增子文库，之后进行二代测序，获取目标区域的序列信息。多重pcr靶向捕获技术与液相杂交捕获测序技术相比，具有以下优势：1.灵敏度高、特异性强、文库构建所需样本量低；2.文库构建周期短，一次文库构建的通量高，文库构建的成本低；3.测序深度高，适合对热点区域进行测序分析。基于以上优势，多重pcr靶向捕获测序技术已受到诸多测序公司的重视，基于该技术开发出的测序产品在测序市场上广受欢迎和好评，并且需求量逐年上升。因此，多重pcr靶向捕获技术已经成为靶向测序技术中的重要一员，在推进全民享受低成本，高质量的靶向测序服务的道路上，发挥着越来越重要的作用。尽管多重pcr靶向捕获测序技术的优势明显，但是该技术仍然存在一些不足，这严重制约了该技术的应用。在利用多重pcr技术进行靶向捕获测序时，获取的数据通常捕获率低、覆盖率低、均一性差，难以满足客户的要求。究其原因，主要是多重pcr反应过程中会产生大量的引物二聚体。引物二聚体不但会直接与目标区域的扩增子竞争引物和dna聚合酶，同时还会加速底物的消耗，从而严重抑制目标区域的扩增。此外，引物二聚体由于片段小，比扩增子更有利于扩增，因此在测序时，引物二聚体更易发生桥式pcr反应成簇，导致测序数据中含有大量无效数据，增加测序的成本。这些问题随着多重捕获区域数目的增多而加剧，已经成为多重pcr靶向捕获测序应用道路上的拦路虎。因此，本领域需要改进的多重pcr技术用于靶向捕获测序。技术实现要素：为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供了一种构建扩增子文库的方法，该方法能够有效去除文库构建过程中产生的引物二聚体，提高测序数据的捕获率，覆盖率和均一性。因此，在第一方面中，本发明提供了一种构建扩增子文库方法，包括以下步骤：s1：采用多重pcr引物对多个目标区域进行扩增，得到多个扩增子；s2：采用cas9/grna系统对所述扩增子进行消化，特异性识别和切割扩增子和引物二聚体两侧的通用序列，去除引物二聚体；s3：依次对所述扩增子进行5’端磷酸化修饰，3’端添加“a”，然后用连接酶将测序接头例如p5和p7连接到扩增子的5’端和3’端；s4：将所述连接后的扩增子磁珠纯化后，得到扩增子文库，然后进行二代测序。在优选的实施方案中，在所述方法的步骤s1中，所述多重pcr引物的3’端为特异性序列，能够与模板互补配对；所述多重pcr引物的5’端为通用序列。在优选的实施方案中，在所述方法的步骤s1中，采用多重pcr引物对多个目标区域进行扩增，所述多重pcr引物的3’端是与目标区域互补配对的特异性序列，5’端是一段长度在23nt以上的通用序列，其3’端的最后三个碱基通常为ngg。ngg序列前面的20碱基序列与cas9/grna系统中grna5’端的20碱基序列相同。在优选的实施方案中，在所述方法的步骤s1和步骤s2之间，采用磁珠对多重pcr扩增产物进行纯化，去除引物，dna聚合酶，dntp等物质，得到高纯度的扩增子和引物二聚体。在优选的实施方案中，在所述方法的步骤s2中，采用cas9/grna系统对扩增子和引物二聚体两侧的通用序列进行特异性切割，去除引物二聚体和扩增子两侧的通用序列，去除引物二聚体。优选地，在所述方法的步骤s2中，采用cas9蛋白酶和grna，对扩增子和引物二聚体进行消化处理，特异性切割掉扩增子和引物二聚体两侧的通用序列，去除引物二聚体。所述cas9蛋白酶包含多种cas9蛋白酶的变体，如切割双链、切割单链以及识别不同pam结构。在优选的实施方案中，在步骤s2和s3中，采用磁珠对s2步骤的酶切产物进行纯化，得到扩增子。在优选的实施方案中，grna的5’端20碱基序列必须与多重pcr引物的5’端通用序列中的ngg序列前面的20个碱基序列一致。grna的来源包括化学合成和体外转录。如果体外使用t7dna聚合酶转录grna，grna的5’端要求添加gg序列，从而被t7dna聚合酶识别。如果使用t4dna聚合酶进行转录，在grna的5’端通常添加x碱基，增加t4dna聚合酶的识别和转录。grna加入到反应体系中的种类与多重pcr引物使用的通用序列种类一致。在优选的实施方案中，在步骤s3中，对扩增子依次进行5’端磷酸化修饰，3’端添加“a”，然后用连接酶将测序接头例如p5和p7连接到扩增子的5’端和3’端。每一步操作结束后，均采用磁珠纯化扩增子。在优选的实施方案中，所述操作步骤s3中，对所述扩增子的5’端进行磷酸化处理，对扩增子的3’端添加“a”，并采用连接酶将测序接头(例如p5和p7)分别连接到所述扩增子的5’端，磁珠纯化后，得到扩增子文库，进行二代测序。在优选的实施方案中，在所述方法的步骤s1、s2和s3后，以及步骤s3中的扩增子5’端磷酸化修饰、扩增子3’端添加“a”、扩增子5’端和3’端分别连接接头序列例如p5和p7等操作后，均采用磁珠对所述扩增子进行纯化。在第二方面中，本发明提供了一种利用cas9/grna系统构建的扩增子文库，所述扩增子文库使用本发明第一方面的方法构建而成。附图说明通过以下附图对本发明进行说明图1：基于cas9/grna系统构建扩增子文库的流程图；图2：crispr/cas9的元件及工作模式图[1]。图3cas9/grna系统构建300重扩增子文库的质检结果。具体实施方式本发明提供了一种构建扩增子文库构建的方法，该方法能够有效去除文库构建过程中产生的引物二聚体，提高测序数据的捕获率，覆盖率和均一性。在本发明中，在所述方法的步骤s1中，所述多重pcr引物的3’端为特异性序列，能够与模板互补配对；所述多重pcr引物的5’端为通用序列。在本发明中，所述多重pcr引物5’端通用序列的长度在23nt以上，且通用序列3’端存在ngg的碱基排列，ngg序列前面的20个碱基序列与cas9/grna系统中grna5’端的20个碱基序列一致。在本发明中，使用多种不同的通用序列，在s2步骤中加入与之序列一致的grna。在本发明中，所述方法的步骤s2中，采用cas9蛋白酶和grna，对扩增子和引物二聚体进行消化处理，特异性切割掉扩增子和引物二聚体两侧的通用序列，去除引物二聚体。在本发明中，所述cas9蛋白酶包含多种cas9蛋白酶的变体，如所述变体切割双链、切割单链以及识别不同pam结构。在本发明中，grna的5’端的20个碱基序列与所述多重pcr引物5’端通用序列中的ngg序列前面的20个碱基序列一致。在本发明中，grna的来源包括化学合成和体外转录，如果体外使用t7dna聚合酶转录grna，grna的5’端要求在原有序列的基础上的添加gg序列，从而被t7dna聚合酶识别；如果使用t4dna聚合酶进行转录，在grna的5’端要求在原有序列的基础上添加x碱基，增加t4dna聚合酶的识别和转录。在本发明中，grna加入到反应体系中的种类与多重pcr引物使用的通用序列种类一致。在本发明中，在所述方法的步骤s3中，对所述扩增子的5’端进行磷酸化处理，对扩增子的3’端添加“a”，并采用连接酶将测序接头列入p5和p7分别连接到所述扩增子的5’端，磁珠纯化后，得到扩增子文库，进行二代测序。在本发明中，在所述方法的步骤s1、s2和s3后，以及步骤s3中的扩增子5’端磷酸化修饰、扩增子3’端添加“a”、扩增子5’端和3’端分别连接接头序列(例如p5和p7)等操作后，均采用磁珠对所述扩增子进行纯化。虽然不希望拘囿于任何理论，但发明人认为crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedpalindromicrepeat)系统可能对本发明的有益效果有促进作用。crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedpalindromicrepeat)系统[1]是发现于细菌中的一种选择性免疫系统，能够特异性识别并切割侵入细菌内的外源gdna,从而保护细菌。crispr/cas9系统主要由三部分组成：tracrrna、cas9蛋白和crrna。tracrrna的核酸序列位于cas9基因的上游，转录后经过iii型核酸酶的作用而成熟，其主要功能与crrna中的重复序列互补配对，介导crrna成熟。cas9蛋白具有两个重要的结构域，分别为hnh和ruvc。hnh切割crrna与靶dna杂交形成的双链，ruvc切割靶dna解开后未配对的单链。此外，nhn和ruvc由一段富含精氨酸的α螺旋链接，该铰链区主要负责与grna-targetdna杂合体结合。crrna的核酸序列由一连串的短重复序列被不同特异序列分隔形成。短重复序列主要与tracrrna结合，特异序列来源于质粒或者外源gdna，能够与外源靶dna互补配对，从而对靶dna进行特异性识别和切割。crispr/cas9识别的靶序列要求在其3’端存在pam序列，其碱基序列通常为ngg。pam序列对于crispr/cas9识别靶dna非常重要，缺失pam结构将导致crispr/cas9无法识别和切割靶dna序列。crispr/cas9的工作流程主要包括以下几个：1.crispr/cas9复合体识别靶dna上游的pam结构，并引发靶dna解链，形成r-loop结构；2.crrna5’的特异性序列(20nt)与解链的靶dna互补配对，形成rna-dna二聚体结构；3.cas9蛋白中hnh结构域在pam上游的第3个碱基处切割rna-dna二聚体，ruvc结构域也在pam序列上游的第3个碱基处切割靶dna中未配对的单链，从而将双链靶dna切断，形成平末端；4.切断的双链通过非同源末端链接(nhej)或者同源修复，便可在切割的位置引入突变，导致靶dna的序列发生改变。研究人员通过分子生物学技术，将tracrrna和crrna融合成一条grna(guiderna)，进一步简化了crispr/cas9编辑靶基因的操作流程。目前，crispr/cas9因其操作简便，特异性高，已经成为靶基因编辑的主流工具。本发明充分利用cas9/grna系统特异性识别和切割靶dna序列的特性，在多重pcr引物的5’端添加一段cas9/grna系统识别的通用序列，经第一轮多重pcr反应后，采用cas9/grna系统对扩增子和引物二聚体两侧的通用序列进行识别和切割，去除引物二聚体，随后对扩增子进行磁珠纯化，5’端进行磷酸化修饰，3’端添加“a”，采用连接酶将测序接头(例如p5和p7)分别连接到扩增子的5’端和3’端，磁珠纯化后得到扩增子文库，进行上机测序。实施例1利用该方法构建单个反应管300重扩增子文库的实施例1如下所示。第1步：300重pcr反应扩增靶向产物1.300重pcr的反应体系如下表1所示：dna聚合酶，缓冲液和dntp均为neb的产品(货号m0493l)；模板是从293t细胞提取得到的gdna；多重引物的浓度为5mm，引物序列分为5’端的通用序列和3’端的特异性序列。所有上游引物5’端的通用序列为5’tctgtctatgacgctgtatccgg3’，所有下游引物5’端的通用序列为5’atccactgacatagtctgtatgg3’。300对多重引物3’端的特异性序列如表2所示。表1300重pcr的反应体系试剂体积(μl)无核酸酶水9.55×q5反应缓冲物510mmdntps0.5引物混合物(5mm)4模板dna(10ng/μl)5q5hotstarthigh-fidelitydna聚合酶(2u/μl)1表2300重引物3’端的特异性序列(seqidno.1-600)1.2300重pcr反应按照下表3进行操作表3300重pcr的反应条件第2步：对第1轮的300重pcr产物进行磁珠纯化2.1向25μl300重pcr产物中加入40μl室温平衡后的ampurexp磁珠，用移液器吸打混匀数次；2.2室温孵育10min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3min；2.3移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl80％乙醇溶液，静置30s；2.4移除上清，再加入180μl80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；2.5室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；2.6将pcr管从磁力架取下，加入22μl无核酸酶水，移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min；2.7将pcr管重新置于磁力架上，静置4min；2.8用移液器吸取20μl上清液，转移到新的200μlpcr管内，管内上清液为多重pcr扩增产物。第3步：grna的体外转录本实施例采用neb公司的sgrna体外转录试剂盒(engentmsgrnasynthesiskit)对靶rna进行体外转录。由于在多重pcr反应中，上下游引物5’端的通用序列不同，因此需要体外转录2条grna。第1条grna(编号为grna1)的体外转录模板为5’ttctaatacgactcactatagtctgtctatgacgctgtatc3’，得到的grna1与cas9蛋白(本实施例采用的cas9蛋白为neb公司的产品(货号m0646))结合后，可以识别并切割扩增产物和引物二聚体中上游引物5’端的通用序列；第2条grna(编号为grna2)的体外转录模板为5’ttctaatacgactcactatagatccactgacatagtctgta3’,得到的grna2与cas9蛋白结合后，可以识别并切割扩增产物和引物二聚体中下游引物5’端的通用序列。3.1grna1和grna2的体外转录反应体系如下表4所示：表4grna体外转录合成的反应体系试剂体积(μl)无核酸酶水3engen2xsgrnareactionmix,s.pyogenes10target-specifcdnaoligo(1μm)5engensgrnaenzymemix2备注：target-specifcdnaoligo为grna1和grna2的体外转录模板3.2将上述反应试剂加入到200μl的pcr反应管之后，37℃孵育30min，然后置于冰盒上暂存；3.3向上述反应体系内加入30μl无核酸酶水，然后加入2μldnasei，振荡混匀离心后，37℃孵育15min，去除反应体系内的dna模板。第4步：grna的纯化第3步体外转录合成的grna使用zymoresearch公司的rna纯化试剂盒(rnaclean&concentratortm-25)进行纯化，具体操作步骤如下：4.1加入100μlrnabindingbuffer到50μlgrna体外转录产物中，振荡混匀；4.2加入150μl100％的乙醇到上述反应体系中，振荡混匀；4.3将离心柱安放于收集管上，并将上述反应液转移到离心柱中(zymo-spintmiiccolumn)，12000g，离心30s，舍弃收集液；4.4加入400μlrnaprepbuffer到离心柱中，离心30s，舍弃收集液；4.5加入700μlrnawashbuffer到离心柱中，离心30s，舍弃收集液；4.6加入400μlrnawashbuffer到离心柱中，离心2min，将离心柱转移到rnase-free的1.5ml离心管中；4.7加入25μlrnase-free的ddh2o于离心柱的核酸吸附膜上，离心30s，得到纯化后的grna。第5步：cas9/grna消化多扩增子和引物二聚体两侧5’端的通用序列，去除引物二聚体5.1本实施例采用的cas9蛋白为neb公司的产品(货号m0646)，首先将cas9蛋白与grna1和grna2混合孵育，制备cas9/grna1和cas9/grna2复合体。反应体系如下表5所示。表5cas9/grna1和cas9/grna2复合体制备的反应体系试剂体积(μl)无核酸酶水1310×cas9nucleasereactionbuffer5grna1(300nm)5grna2(300nm)5cas9nuclease,s.pyogenes(1μm)25.2将上述反应试剂混合后，25℃孵育10min；5.3向上述反应体系内加入20μl第2步纯化得到的多重pcr产物，总体积为50μl，然后混匀离心，37℃孵育2h，消化多重pcr产物及引物二聚体两侧5’端的通用引物序列，去除引物二聚体；第6步：磁珠纯化第5步的消化产物6.1向50μl消化产物中加入75μl室温平衡后的ampurexp磁珠，用移液器吸打混匀数次；6.2室温孵育10min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3min；6.3移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl80％乙醇溶液，静置30s；6.4移除上清，再加入180μl80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；6.5室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；6.6将pcr管从磁力架取下，加入32μl无核酸酶水，移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min；6.7将pcr管重新置于磁力架上，静置4min；6.8用移液器吸取30μl上清液，转移到新的200μlpcr管内，管内上清液为去除两侧通用引物序列的多重pcr产物；第7步：对扩增子的5’端添加磷酸基团7.1本实施例中，对多重pcr产物5’端添加磷酸基团的试剂为kapabiosystems公司的产品(货号kk8234)，反应体系如下表6所示：表6扩增子5’端磷酸化修饰的反应体系试剂体积(μl)水3endrepairbuffer(10x)4endrepairenzymemix3多重pcr产物30备注：多重pcr产物为第6步纯化得到的多重pcr产物7.2将上述反应试剂混合后，振荡混匀，离心，20℃孵育30min；第8步：对5’端添加磷酸基团的扩增子进行磁珠纯化8.1向40μl5’端添加磷酸基团后的多重pcr产物加入60μl室温平衡后的ampurexp磁珠，用移液器吸打混匀数次；8.2室温孵育10min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3min；8.3移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl80％乙醇溶液，静置30s；8.4移除上清，再加入180μl80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；8.5室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发，得到的磁珠上有5’端磷酸化后的多重pcr产物，直接作为下一步反应的底物；第9步：对扩增子的3’端添加“a”9.1本实施例采用的试剂为kapabiosystems公司的产品(货号kk8234)，反应体系如下表7所示：表7扩增子3’端添加“a”的反应体系9.2将上述反应试剂混合后，振荡混匀，30℃孵育30min；第10步：对3’端添加“a”后扩增子进行磁珠纯化10.1向上述50μl反应体系内，加入90μlpeg/nacl溶液，用移液器上下吹打混匀；10.2室温孵育10min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3min；移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl80％乙醇溶液，静置30s；10.3移除上清，再加入180μl80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；10.4室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发，磁珠结合的扩增子，直接作为下一步反应的底物；第11步：将5’端含有磷酸基团和3’端添加“a”后的扩增子与illumina平台的测序接头连接，得到扩增子文库11.1本实施例中采购的dna连接酶为kapabiosystems的产物(货号kk8235)。连接的反应体系如下表8所示。表8扩增子与测序接头序列连接的反应体系11.2将上述反应试剂混合后，振荡混匀，20℃孵育15min；第12步：对连接后的扩增子文库进行磁珠纯化12.1向上述50μl反应体系内，加入50μlpeg/nacl溶液，用移液器上下吹打混匀；12.2室温孵育10min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3min；12.3移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl80％乙醇溶液，静置30s；12.4移除上清，再加入180μl80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；12.5室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；12.6将pcr管从磁力架取下，加入22μl无核酸酶水，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；12.7将pcr管重新置于磁力架上，静置4min；12.8用移液器吸取20μl上清液，转移到新的200μlpcr管内，管内上清液为多重pcr扩增产物。第13步：对纯化后的扩增子文库进行pcr扩增，提高扩增子文库的浓度13.1本实施例采用的引物和dna聚合酶均为kapabiosystems公司的产品(货号kk2600)。pcr的反应体系如下表9所示：表9扩增子文库扩增的反应体系试剂体积(μl)kapahifihotstartreadymix(2x)25libraryamplifcationprimermix(10x)5adapter-ligatedlibrarydna2013.2将上述反应成分混合后，震荡混匀，离心，然后按照下表10进行pcr反应扩增；表10扩增子文库pcr的反应条件第14步：对pcr产物进行磁珠纯化，得到高浓度的文库14.1向50μlpcr产物中加入70μl室温平衡后的ampurexp磁珠，用移液器吸打混匀数次；14.2室温孵育10min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3min；14.3移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl80％乙醇溶液，静置30s；14.4移除上清，再加入180μl80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；14.5室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；14.6将pcr管从磁力架取下，加入22μl无核酸酶水，移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min；14.7将pcr管重新置于磁力架上，静置4min；14.8用移液器吸取20μl上清液，转移到新的200μlpcr管内，管内上清液为多重pcr扩增产物。第15步：对扩增子文库进行浓度测量取2μl文库使用3.0fluorometer(qubitdsdnahsassaykit)进行浓度测量，得到的文库浓度为7.84ng/μl；第16步：对扩增子文库的片段分布进行质检取2μl扩增子文库使用qsep100全自动核酸蛋白分析系统(厚泽生物)进行质检，得到的质检峰图如图3所示：文库的靶条带位置正确，分布250-420bp之间，主峰位置在356bp；文库中基本没有引物二聚体。第17步：对文库进行二代测序并进行数据分析采用illumina公司的next-seq500测序平台对上述文库进行二代测序，对得到的测序数据进行统计分析，结果如下表11所示：文库的碱基质量评分(％)为90.12％，比对率为99.56％，覆盖率为100％，20％平均测序深度为98.84％，均一性高。文库的各项数据指标表现优异。表11cas9/grna系统构建300重扩增子文库的测序数据统计结果参考文献：[1]doudnaja,charpentiere.genomeediting.thenewfrontierofgenomeengineeringwithcrispr-cas9.science.2014nov28；346(6213):1258096.。当前第1页12