土壤尿液DNA提取试剂盒及方法与流程

本发明属于核酸提取纯化技术领域，具体涉及一种土壤尿液dna提取试剂盒及方法。

背景技术：

二氧化硅能在盐和特定ph值条件下可逆的结合dna，这也是硅珠法、磁珠法、硅胶膜法提取dna的理论基础；在高浓度离液盐和低ph值条件下，二氧化硅能通过氢键与dna结合，而蛋白质、脂类、糖类等杂质因不能被结合从而被去除，去除离液盐、提高ph值之后，dna与二氧化硅之间的相互作用力减弱，dna从二氧化硅表面释放，从而获得纯化的dna；土壤中含有大量的二氧化硅成分，因此，对土壤样品进行dna提取时，需要考虑样品来源的二氧化硅对dna的结合，一旦dna与样品来源的二氧化硅发生结合，dna就会随着土壤固体颗粒物质一起被去除。

尿液中含有一定量的dna，可以通过多种方法提取dna，并用于pcr检测、str分型检测、二代测序分析；但是，尿液中dna含量较低，尿液浸润土壤后，被土壤吸附的dna含量更低，要针对土壤尿液进行dna提取，具有一定难度。

技术实现要素：

本发明为解决上述存在的问题，提供了一种土壤尿液dna提取试剂盒及方法，其解决技术问题的技术方案是：

土壤尿液dna提取试剂盒，包括以下试剂：

（a）土壤裂解液，其组成成分包括表面活性剂、螯合剂、ph缓冲剂；

所述表面活性剂为：十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、月桂酰基肌氨酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、tween20、tween40、tween60、tween80、np40、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或两种及以上的混合，所述表面活性剂的质量浓度为1-100g/l，优选的表面活性剂成分是十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠中的一种或两种的混合，优选的表面活性剂质量浓度为1-10g/l；

所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钾中的一种或两种，所述离液盐的浓度为1-100mmol/l；

所述ph缓冲剂为tris-hcl、tris-醋酸、nah2po4-na2hpo4、kh2po4-k2hpo4、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠，所述ph缓冲剂的ph值为7.0-11，优选的ph缓冲剂为tris-hcl，优选的ph缓冲剂的ph值为7.5-8.5；

（b）结合液，其组成成分包括表面活性剂、离液盐、ph缓冲剂；

所述表面活性剂为：聚乙二醇辛基苯基醚、tween20、tween40、tween60、tween80、np40中的一种或两种及以上的混合，所述表面活性剂的质量浓度为1-100g/l；

所述离液盐为异硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钾、高氯酸钠、碘化钾、碘化钠中的一种或两种及以上的混合，所述离液盐的浓度为3-5mol/l；

所述ph缓冲剂为tris-hcl、tris-醋酸、nah2po4-na2hpo4、kh2po4-k2hpo4、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠，所述ph缓冲剂的ph值为4.5-7.0；

（c）漂洗液，所述漂洗液为70-80%乙醇；

（d）洗脱液，其组分为：10mmol/ltris-hcl，0.1mmol/l乙二胺四乙酸二钠，ph8.0；

（e）硅基dna吸附材料，所述硅基dna吸附材料为二氧化硅纳米颗粒、硅胶膜、玻璃纤维膜、石英膜、二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒中的任意一种。

使用本发明的试剂盒，用以提取土壤尿液dna的方法，包括以下步骤：

1）dna提取

用土壤裂解液和蛋白酶k裂解含有尿液的土壤样品，离心分离土壤和上清液，上清液加入结合液，混合后加入硅基dna吸附材料，分离硅基dna吸附材料和液体，漂洗硅基dna吸附材料，洗脱dna；具体包括以下步骤：

a.刮取含有尿液的表层土壤，烘干，取100-200mg土壤样品，加入样品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震荡混匀后，75℃加热裂解15分钟；

b.最大转速离心5分钟，将上清液转移至新的样品管中，加入800ul结合液，混匀；

c.将上一步的混合液转移至硅基dna吸附材料，分离液体和硅基dna吸附材料；

d.用漂洗液漂洗硅基dna吸附材料；

e.用洗脱液洗脱硅基吸附材料中的dna；

2）pcr扩增及电泳

将上步纯化的dna进行pcr扩增，在电泳仪中检测dna。

本发明具有以下有益效果：

本发明的土壤尿液dna提取试剂盒及方法，配制好土壤裂解液、结合液、漂洗液、洗脱液，利用特殊成分的土壤裂解液，在加入结合液之前，样品土壤来源的二氧化硅不与dna结合，离心分离固体颗粒和溶解了dna的上清液，上清液中加入结合液，混合后转入含有硅基dna吸附材料中，分离液体和硅基dna吸附材料，漂洗硅基dna吸附材料，洗脱获得纯化dna；与现有技术相比，本发明技术克服了样品土壤来源的二氧化硅对dna的吸附，从而减少了不必要的dna损失，可达到获取高质量、高产量土壤尿液dna目的。

附图说明

图1是本发明实施例1中提取的dna的复合str扩增图谱。

图2是本发明实施例2中提取的dna的复合str扩增图谱。

图3是本发明实施例3中提取的dna的复合str扩增图谱。

图4是本发明实施例4中提取的dna的复合str扩增图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1以二氧化硅纳米颗粒提取土壤尿液dna。

1）dna提取

刮取含有尿液的表层土壤，烘干，取100-200mg土壤样品，加入样品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震荡混匀后，75℃加热裂解15分钟；最大转速离心5分钟，将上清液转移至新的样品管中，加入800ul结合液，混匀；混合液转移至装有15ul二氧化硅纳米颗粒的离心管中，混匀后静止15分钟；8000rpm离心1分钟去除上清液；加入500ul漂洗液，混匀，8000rpm离心1分钟去除上清液；加入500ul漂洗液，混匀，8000rpm离心1分钟去除上清液；70℃加热3分钟；加入20ul洗脱液，震荡混匀，70℃加热3分钟；8000rpm离心1分钟，上清dna溶液转移至新的离心管中。

2）pcr扩增及电泳

pcr扩增使用identifilerplus试剂盒，10μl扩增体系中含4μlmastermix、2μlprimerset、4μl模板，扩增程序为，95℃，11分钟；94℃，20秒，59℃，3分钟，30个循环；60℃，10分钟；4℃保存；电泳在abi3500xl仪器中进行；电泳上样体系为，1μlpcr产物，9μl甲酰胺，其中已加liz。

实施例2以硅胶膜提取土壤尿液dna

1）dna提取

刮取含有尿液的表层土壤，烘干，取100-200mg土壤样品，加入样品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震荡混匀后，75℃加热裂解15分钟；最大转速离心5分钟，将上清液转移至新的样品管中，加入800ul结合液，混匀；混合液转移至装有硅胶膜的离心柱中，12000rpm离心1分钟；倒弃收集管中废液，加入500ul漂洗液，12000rpm离心1分钟；倒弃收集管中废液，加入500ul漂洗液，12000rpm离心1分钟；倒弃收集管中废液，12000rpm离心3分钟，将离心柱转移至新的离心管中，70℃加热3分钟；加入20ul洗脱液，70℃加热3分钟；12000rpm离心1分钟，丢弃离心柱，离心管中液体即为dna溶液。

2）pcr扩增及电泳

pcr扩增使用identifilerplus试剂盒，10μl扩增体系中含4μlmastermix、2μlprimerset、4μl模板，扩增程序为，95℃，11分钟；94℃，20秒，59℃，3分钟，30个循环；60℃，10分钟；4℃保存；电泳在abi3500xl仪器中进行；电泳上样体系为，1μlpcr产物，9μl甲酰胺，其中已加liz。

实施例3以玻璃纤维膜提取土壤尿液dna

1）dna提取

刮取含有尿液的表层土壤，烘干，取100-200mg土壤样品，加入样品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震荡混匀后，75℃加热裂解15分钟；最大转速离心5分钟，将上清液转移至新的样品管中，加入800ul结合液，混匀；混合液转移至装有玻璃纤维的离心柱中，12000rpm离心1分钟；倒弃收集管中废液，加入500ul漂洗液，12000rpm离心1分钟；倒弃收集管中废液，加入500ul漂洗液，12000rpm离心1分钟；倒弃收集管中废液，12000rpm离心3分钟，将离心柱转移至新的离心管中，70℃加热3分钟；加入20ul洗脱液，70℃加热3分钟；12000rpm离心1分钟，丢弃离心柱，离心管中液体即为dna溶液。

2）pcr扩增及电泳

pcr扩增使用identifilerplus试剂盒，10μl扩增体系中含4μlmastermix、2μlprimerset、4μl模板，扩增程序为，95℃，11分钟；94℃，20秒，59℃，3分钟，30个循环；60℃，10分钟；4℃保存；电泳在abi3500xl仪器中进行；电泳上样体系为，1μlpcr产物，9μl甲酰胺，其中已加liz。

实施例4以石英膜提取土壤尿液dna

1）dna提取

刮取含有尿液的表层土壤，烘干，取100-200mg土壤样品，加入样品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震荡混匀后，75℃加热裂解15分钟；最大转速离心5分钟，将上清液转移至新的样品管中，加入800ul结合液，混匀；混合液转移至装有石英膜的离心柱中，12000rpm离心1分钟；倒弃收集管中废液，加入500ul漂洗液，12000rpm离心1分钟；倒弃收集管中废液，加入500ul漂洗液，12000rpm离心1分钟；倒弃收集管中废液，12000rpm离心3分钟，将离心柱转移至新的离心管中，70℃加热3分钟；加入20ul洗脱液，70℃加热3分钟；12000rpm离心1分钟，丢弃离心柱，离心管中液体即为dna溶液。

2）pcr扩增及电泳

pcr扩增使用identifilerplus试剂盒，10μl扩增体系中含4μlmastermix、2μlprimerset、4μl模板，扩增程序为，95℃，11分钟；94℃，20秒，59℃，3分钟，30个循环；60℃，10分钟；4℃保存；电泳在abi3500xl仪器中进行；电泳上样体系为，1μlpcr产物，9μl甲酰胺，其中已加liz。

实施例5以二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒提取土壤尿液dna

1）dna提取

刮取含有尿液的表层土壤，烘干，取100-200mg土壤样品，加入样品管中，然后加入400ul土壤裂解液和20ul蛋白酶k，震荡混匀后，75℃加热裂解15分钟；最大转速离心5分钟，将上清液转移至新的样品管中，加入800ul结合液，混匀；混合液转移至装有15ul二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒的离心管中，混匀后静止15分钟；上磁力架吸附2分钟，吸弃上清液；加入500ul漂洗液，混匀，上磁力架吸附1分钟，吸弃上清；加入500ul漂洗液，混匀，上磁力架吸附1分钟，吸弃上清；70℃加热3分钟；加入20ul洗脱液，震荡混匀，70℃加热3分钟；上磁力架吸附1分钟，上清dna溶液转移至新的离心管中。

2）pcr扩增及电泳

pcr扩增使用identifilerplus试剂盒，10μl扩增体系中含4μlmastermix、2μlprimerset、4μl模板，扩增程序为，95℃，11分钟；94℃，20秒，59℃，3分钟，30个循环；60℃，10分钟；4℃保存；电泳在abi3500xl仪器中进行；电泳上样体系为，1μlpcr产物，9μl甲酰胺，其中已加liz。

以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化；凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。