一种提高CIK细胞对胃癌杀伤力的化合物及其制剂的制作方法

本发明属于细胞免疫领域，涉及cik细胞，具体涉及一种提高cik细胞对胃癌杀伤力的化合物及其制剂。
背景技术：
：肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段日益受到重视。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercell，cik)是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤生物免疫治疗的主力军。cik细胞的主要效应细胞为cd3+cd56+表型t淋巴细胞，兼有nk细胞和t细胞的特征。在功能上，cik一方面拥有t淋巴细胞强大抗肿瘤活性，另一方面拥有nk细胞非mhc限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。胃癌是世界上排名第四的恶性肿瘤，全球每年约有70多万人死于胃癌，占全部恶性肿瘤死亡人数的10％左右。我国最新公布的肿瘤数据显示，胃癌的发病率和死亡率分别位居全国第二和第三。胃癌常好发于50岁以上的中老年人并逐渐呈现年轻化的趋势。胃癌的具体发病原因并不清楚，可能与个体遗传、不健康饮食和环境以及幽门螺杆菌的长期感染等因素相关。胃癌的发生发展和临床转归受到胃癌微环境中各种细胞相互调控的影响，其中抗肿瘤效应性免疫细胞受到抑制性的调控与胃癌的进展及病人的临床预后不良密切相关。因此，提高包括cik细胞在内的免疫细胞对胃癌细胞的杀伤力对胃癌的治疗，控制胃癌的进展，以及病人的临床预后具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种提高cik细胞对胃癌杀伤力的化合物及其制剂。本发明通过如下技术方案得以实现：如下结构通式的吡咯化合物在制备提高cik细胞对胃癌杀伤力的药物中的应用：其中，r选自烷基或芳香烷基。优选地，所述吡咯化合物选自如下结构：一种药物制剂，含有上述吡咯化合物。优选地，所述药物制剂还含有药学上可以接受的载体，制备成药学上可以接受的剂型。上述药物制剂在制备提高cik细胞对胃癌杀伤力的药物中的应用。本发明优点：本发明提供的吡咯化合物可以显著提高cik细胞对胃癌细胞的杀伤力，可以用于制备治疗胃癌的药物。附图说明图1为不同处理cik细胞对胃癌bgc-823细胞的杀伤活性；图2为各吡咯化合物对裸鼠胃癌移植瘤的体内抑瘤作用。具体实施方式为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。实施例1：细胞水平试验一、实验材料胃癌bgc-823细胞购于中国科学院上海细胞研究所；10％胎牛血清和rpmi-1640培养液购于gibco公司；乳酸脱氢酶(ldh)细胞毒性检测试剂盒购于biovision公司；编号为吡咯c-1、c-2、c-3的化合物均为已知化合物，委托外包公司合成。二、实验方法1、cik细胞的分离和培养(1)单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20ml，预冷的pbs1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，rpmi-1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％co2孵箱中孵育2h。(2)cik细胞的培养：收集单核细胞中的悬浮细胞，调整细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)，并于24h后添加il-2(300u/ml)、il-1α(l00u/ml)和抗人cd3单抗(50μg/ml)。每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子，连续培养8天，收集细胞备用。2、胃癌细胞株bgc-823的培养取复苏后的胃癌bgc-823细胞加入细胞培养瓶，随后加入含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液15ml，于37℃、5％co2的培养箱中培养。每天观察细胞生长情况，根据细胞生长情况进行换液。待细胞铺满瓶底时，用2.5g/l胰蛋白酶消化细胞使其脱壁，收集细胞后离心800r/min×3min，弃去上清，使用生理盐水反复吹打混匀细胞，计数后用于实验。3、cik细胞对胃癌bgc-823细胞的杀伤活性采用ldh释放法测定cik细胞对胃癌bgc-823细胞的杀伤活性，步骤如下：取培养8d的cik细胞铺入6孔板，实验组加入不同的吡咯化合物(编号吡咯c-1、c-2、c-3，终浓度为5μm、10μm)，对照组加入等体积溶剂dmso，继续培养24h，收集cik细胞作为效应细胞，对数生长期胃癌bgc-823细胞作为靶细胞，将效应细胞和靶细胞分别配成2×106/ml和2×105/ml的细胞悬液，效靶细胞等体积混合(效靶细胞数比例为10:1)。将混合后的效靶细胞置于37℃、5％co2培养箱中孵育4h后，离心1500r/min×10min，取上清液。按乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒说明书操作，340nm波长下测定吸光度值(a)，每检测样本设3个复管，实验重复3遍。cik细胞的杀伤活性(％)＝(a实验组-a效应细胞自然释放组)/(a靶细胞最大释放组-a靶细胞自然释放组)×100％。4、统计学处理采用spss13.0软件进行统计分析，用均值±标准偏差表示，多组间比较采用单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。三、实验结果1、人cik细胞的培养及鉴定从外周血分离获得单个核细胞，通过诱导刺激得到cik细胞。经过传代培养，使用mtt检测试剂盒分析cik细胞的增殖活性，从570nm的吸光值结果可以看出，初种细胞后的1-2d，cik细胞生长缓慢，d3细胞进入快速生长期，6d以后细胞生长速度减缓。提取培养8d的cik，通过流式细胞仪检测其表面标志物，cik细胞表面cd3+cd8+、cd3+cd56+双阳性比率分别为59.4％、56.7％，纯度较高。2、吡咯化合物对cik细胞杀伤胃癌bgc-823细胞的影响表1和图1为不同处理cik细胞对胃癌bgc-823细胞的杀伤活性。表1不同处理cik细胞对胃癌bgc-823细胞的杀伤活性(％，n＝3)表1和图1可以看出，与对照组相比，本发明提供的吡咯化合物可以有效增强cik细胞对胃癌细胞的杀伤活性，且呈一定的浓度依赖性。实施例2：动物水平试验一、实验材料balb/c裸鼠，均选用雌性裸鼠，鼠龄6-7周，体重18-23g，在spf条件下的裸鼠室内饲养，由南京大学实验动物中心提供。胃癌bgc-823细胞购于中国科学院上海细胞研究所。二、实验方法在无菌条件下，在雌性裸鼠右侧腋部皮下注射1×106/0.2ml的人胃腺癌bgc-823细胞。裸鼠在接种肿瘤细胞次日按照体重随机分成给药组(分别给予吡咯c-1、c-2、c-3)和对照组(给予等体积生理盐水)。当移植瘤长到第15天时开始，分别给予腹腔注射等体积生理盐水、8mg/kg吡咯化合物。各组均每天给药1次，连续20天。停药后将裸鼠拉颈处死，小心剥离皮下肿瘤，并称重，按下述公式计算抑瘤率(％)：抑瘤率(％)＝(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重×100％。三、实验结果表2和图2为各组吡咯化合物对裸鼠胃癌移植瘤的体内抑瘤率(％)。表2各吡咯化合物对裸鼠胃癌移植瘤的体内抑瘤率(％，n＝6)吡咯化合物编号抑瘤率(％)吡咯c-160.3±5.8吡咯c-275.7±6.4吡咯c-364.8±5.2从表2和图2可以看出，本发明提供的吡咯化合物对裸鼠胃癌移植瘤具有显著的体内抑制作用，结合细胞水平实验结果，吡咯化合物很有可能是通过提高cik细胞对胃癌移植瘤杀伤作用而实现体内抑瘤效果的。本发明提供的吡咯化合物可以显著提高cik细胞对胃癌细胞的杀伤力，可以用于制备治疗胃癌的药物。上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。当前第1页12