Blec蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及鸡c-型凝集素样受体蛋白blec单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明进一步涉及它们在检测blec蛋白的组织学分布、体内和体外表达中的应用，属于鸡凝集素样受体蛋白blec单克隆抗体的制备和应用领域。

背景技术：

鸡blec基因位于主要组织相容性复合体(majorhistocompabilitycomplex,mhc)的核心区域，在不同单倍型之间保守性较强。根据编码蛋白的推导氨基酸序列分析，为c-型凝集素样结构，可能与鸡的自然杀伤细胞非mhci类分子介导的细胞杀伤功能有关。但至今blec蛋白的结构、在鸡体内的组织学分布尚未见明确报道。

利用blec蛋白特异性单克隆抗体，可通过免疫组织化学技术分析鸡体内blec蛋白的组织学分布，这对于研究blec蛋白的结构、生物学功能以及在鸡体内的组织学分布具有重要的价值。

技术实现要素：

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株稳定分泌blec蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明所要解决的第二个技术问题是将该杂交瘤细胞株分泌的blec蛋白单克隆抗体应用于检测鸡体内的blec蛋白的表达或分布。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明为获得mhc单倍型鸡保守的blec蛋白特异性单抗，并适合于blec蛋白功能研究，本发明根据网上公布的所有不同单倍型鸡blec基因序列，比对推导氨基酸序列结果，发现存在5个变异位点，为了获得适用于表面配体功能分析的单抗，本发明最终确定选择ala59-leu176区域进行表达。选择最保守的b21单倍型鸡为实验材料，参考标准序列设计引物，扩增blec胞外区(ala59-leu176)基因，构建pet-blec21重组质粒，以保证获得型通用型单抗。iptg诱导pet-blec21原核表达重组菌，超声波破碎，用盐酸胍处理，获得包涵体；在复性液中复性，浓缩，凝胶过滤层析柱中纯化蛋白，获得纯化的blec蛋白。

取7周龄无特定病原体balb/c雌性小鼠，用纯化的blec蛋白进行免疫，50μg/小鼠，腹腔注射。每隔2周免疫一次，第3次免疫后一周采集免疫鼠血，37℃放置1h，4℃离心10min分离血清。将血清倍比稀释，用间接elisa检测血清效价，选择血清效价最高的小鼠于融合前3天加强免疫。将免疫鼠脾细胞与sp2/0细胞融合，经过3次筛选和3次亚克隆，获得特异性强、稳定性好的单克隆细胞株blec-3d3。

本发明对单克隆细胞株blec-3d3进行亚类鉴定，鉴定结果显示，blec-3d3的重链是igm，轻链为kappa链。

westernblot鉴定结果表明，blec-3d3能特异性检测到鸡体内黏膜免疫相关组织中的blec蛋白。

本发明将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株blec-3d3提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：cgmccno.12998；分类命名为：balb/c小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2016年10月26日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

流式细胞术检测结果表明，应用本发明的blec单抗可用于检测鸡外周血中表面表达blec蛋白的细胞种类。

免疫组化检测结果表明，应用本发明的blec单抗可用于检测鸡体内blec蛋白的组织学分布。

附图说明

图1为鸡blec基因胞外区与人和小鼠c-型凝集素受体家族2型(clec2)的氨基酸序列同源性比较结果。

图2为blechiload16/60superdextm75pregrade[global]纯化结果。

图3为blec-3d3细胞上清对原核表达产物的westernblot鉴定结果：1：pet-30a载体转化菌；2：pet-blec重组质粒转化菌。

图4为应用本发明blec单抗采用流式细胞术检测鸡外周血淋巴细胞表面blec蛋白的表达结果。

图5为应用本发明blec单抗进行免疫组化检测鸡blec蛋白组织分布的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1mhc‐b单倍型鸡c‐型凝集素样受体蛋白blec单抗细胞株的构建和鉴定

1.免疫原blec蛋白型保守区域的选择

为获得mhc单倍型鸡保守的blec蛋白特异性单抗，并适合于blec蛋白功能研究，本发明根据网上公布的所有不同单倍型鸡blec基因序列，比对推导氨基酸序列结果，存在5个变异位点(下表中加粗下划线表示)。选择最保守的b21单倍型鸡为实验材料，参考序列设计引物，扩增blec基因，构建pet-blec21重组质粒，以保证获得型通用型单抗。

表1鸡不同单倍型blec基因推导氨基酸的突变位点

mhcb单倍型氨基酸位点

对blec蛋白胞外区c型凝集素样结构域序列的进化分析结果表明，其与结构已解析的人和小鼠c-型凝集素样结构域第2亚群(clec2)家族相似度较高(图1)。由于哺乳动物的clec2具有自然杀伤细胞(nk细胞)配体的作用，推测鸡blec蛋白也可能是鸡nk细胞的配体。为了获得适用于表面配体功能分析的单抗，本发明选择ala59-leu176区域进行表达。

2.blec基因的扩增与原核表达

根据ncbi公布的mhc-b21单倍型鸡blec序列(ncbiacc.no:am950195)设计一对引物：

上游：5′-ccatatggcgcagtgcccgttcgattggattg-3′，

下游：5′-ccctcgagttacaacgcgggtttggtgcaaacc-3′，以无特定病原体(specificpathogenfree，spf)b21单倍型鸡外周血淋巴细胞总rna为模板，rt-pcr反应获得blec胞外区(ala59-leu176)cdna，克隆入大肠杆菌表达载体pet-30a，转化e.colibl21(de3)感受态细胞，构建成功原核表达重组质粒pet-blec21；所表达的氨基酸序列为：maqcpfdwigfggkcyyfsedesnwtssqnncsalgaslavfdsaedlsftmrhkgssphwvglsregkehpwewvnrsplshlfqvqgdglcaylgdaglssshcsarrnwvctkpal(seqidno.1)；

3.免疫原形式的筛选

为获得结合力强、特异性好的单抗，采用2种途径制备免疫原，根据被免小鼠的血清抗体效价，选择效价高的被免小鼠进一步制备单抗。

3.1sds-page凝胶条免疫

大量培养、诱导表达pet-blec21重组菌，按照包涵体的提取方式，进行超声波破碎、离心，与5×上样缓冲液混匀、煮沸后，进行sds-page电泳。采用没有梳齿的上样条，上样。电泳结束后，常规考马斯亮蓝染液染色30min，沸水浴30min脱色，期间多次换水，直至背景清亮无色，目的带清晰。根据标准分子量，用75％乙醇擦拭消毒过的刀片，准确切下目的条带。尽量碾碎后，用pbs重悬，作为免疫原。

3.2blec蛋白纯化产物免疫

iptg诱导pet-blec21原核表达重组菌，菌体6000r/min离心20min取沉淀。超声波破碎，用盐酸胍溶液处理，获得包涵体。在100mmtrisph8.0、400mml-arghcl和2mmedta复性液(加入氧化还原对5mmgsh/1mmgssg)中复性8h，浓缩(浓缩buffer1l:20mmtris/50mmnacl)，凝胶过滤层析柱中纯化蛋白。选用supredex75bg，20mmtris/50mmnaclph8.5条件纯化。

sds-page实验结果(图2)表明blec蛋白以包涵体形式表达。图2中，sds-page结果上部分后边泳道的显色条带对应凝胶过滤层析柱图的前面小峰，图下部前边泳道的显色条带对应凝胶过滤层析柱图的高峰，峰值高于2000mau。峰图结果显示，蛋白纯度较高，浓度为15mg/ml。适当稀释，以50μg/鼠，进行免疫。

取7周龄的balb/c雌性小鼠，分别用上述3.1和3.2制备的免疫原腹腔注射免疫小鼠，各免疫3只。7天后再免，2免后一周采集、分离免疫鼠血清。以终浓度为200ng/100μl的blec纯化蛋白包被酶标板，用间接elisa法检测od450值。结果切胶免疫鼠的od450值平均为0.343，纯化蛋白免疫鼠的od450值为0.458，空白对照孔为0.017。表明利用纯化蛋白进行免疫，获得的抗血清效价优于切胶免疫。之后全部采用纯化蛋白进行免疫，隔2周免疫一次，再免疫2次后，常规技术融合，制备单抗。

4.阳性杂交瘤株的筛选

将被免疫鼠摘眼球采血致死，无菌摘取脾脏，用注射器内芯于300目铜网上分散脾细胞。与适量小鼠骨髓瘤细胞sp2/0细胞混合，离心后，分装到含有饲养层细胞的96孔细胞板培养。10-12天后，选择培养液发黄的细胞孔逐个检测。判定阳性标准为：(样品孔od450nm－空白对照od450nm)/(阴性对照孔od450nm－空白对照d450nm)>2.1。

多次筛选和亚克隆，淘汰抗体分泌不稳定、效价不高的细胞，最终获得符合要求的单克隆细胞株blec-3d3。

5.亚型鉴定

应用rapidelisamousemabisotypingkit说明书对blecmab进行亚类鉴定。用na2co3/naco3包被blec蛋白，浓度为200ng/ul。5％脱脂乳封闭3h后，加blec-3d3细胞上清，37℃孵育1h,再加试剂盒中的二抗(1:800稀释)，37℃孵育30min。结果显示，blec-3d3的重链是igm，轻链为kappa链。

6.杂交瘤细胞腹水的制备及westernblot鉴定

取8-12周龄balb/c小鼠腹腔注射石蜡油0.5ml/只，一周后腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠约10⁶个细胞，常规技术制备腹水。对blec原核表达产物及pet-30a载体转化菌进行sds-page电泳，进行半干转印和脱脂乳封闭。封闭好的nc膜放入blec-3d3细胞腹水中，室温作用1h，pbst洗涤3次，5min/次；以8000倍稀释的hrp酶标记的山羊抗鼠igg为二抗，室温作用1h，pbst洗涤3次，5min/次。红外线扫膜仪显色。结果显示blec-3d3能特异性检测到blec蛋白(图3)。

实验例1blec蛋白在外周血淋巴细胞的表达

加5ml鸡淋巴细胞分离液于15ml离心管中，再缓慢等量加入72周龄spf鸡翅静脉柠檬酸钠抗凝血。2000r/min离心15min，取中间环状乳白色淋巴细胞层。用1×pbs洗2次，每次5min。将分离到的细胞等体积分成3份，每份500ul。其中1份不染色，做阴性对照设门，将另外细胞分别加入适量blec-3d3腹水及商品化的鸡cd3单抗、cd4单抗、cd8单抗和b细胞单抗，于37℃避光30min；1600r/min离心5min，弃掉上清，用pbs洗2次，每次5min；用pbs重悬细胞，加入fitc标记的山羊抗鼠igg(h&l)，37℃避光30min，用1×pbs重悬细胞，300目铜网过滤后，用流式细胞仪检测。结果表明有1％的细胞表面表达blec蛋白，分布在cd3+和cd4+细胞表面(图4)；检测结果表明，应用本发明的blec单抗可用于检测鸡外周血中表面表达blec蛋白的细胞种类。

实验例2免疫组化检测blec蛋白在鸡体组织中的分布

剖取12周龄spf鸡的脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、心脏、法氏囊、胸腺和盲肠扁桃体，保存于装有30ml10％甲醛固定液的50ml离心管中，固定。用石蜡包埋并切片。染色步骤参照免疫组织化学试剂盒说明书进行，抗blec蛋白特异性单抗blec-3d3稀释度为1∶100。染色完成后在光学显微镜下观察。结果在法氏囊上皮、肺三级支气管的平滑肌细胞、肾、小肠平滑肌、胸腺哈氏小体和脾髓质中检测到较强的特异性阳性信号，而在心脏和肝脏未检测到(图5)；实验结果表明，应用本发明的blec单抗可用于检测鸡体内blec蛋白的组织学分布。

sequencelisting

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>blec蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

<130>hlj-2001-170109a

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