一种工程化心肌组织中心肌细胞去分化重塑的方法与流程

本发明涉及一种心肌细胞，特别涉及一种工程化心肌组织中心肌细胞去分化重塑的方法。

背景技术：

近年来心肌组织工程发展迅速，以生物支架材料和种子细胞为基础构建的组织工程化心肌组织技术已越来越成熟。工程化心肌组织具有很大的潜在发展空间。新近研究表明，通过体外组织工程手段构建的心肌组织不仅可以实现心肌细胞的损伤修复，心脏组织的重构等，而且还被认为是体外探讨心肌生理病理问题的良好模型体系。在过去几年中，已有大量文献报道利用生物材料结合种子细胞来模拟天然心肌组织的结构，成功构建出能够节律性收缩的心脏组织，并实现了对心肌细胞功能的调控。然而，在心肌组织的构建中仍然存在许多挑战，且越来越多的研究者认为利用发育生物学原理指导工程化心肌组织的构建对于改善构建的心肌组织质量具有重要意义。

对于组织工程化心肌组织构建的研究，以往研究者大部分把落脚点放在如何构建出与在体组织高度相关的心肌组织模型。近十几年，心脏干细胞作为种子细胞的来源已经吸引了大量的心肌组织工程研究者的关注，且已被证实在修复受损心脏组织中具有很大潜能。而受限于心脏干细胞的数量，当心脏组织受损超过一定程度其修复效果受到限制。近几年研究者将目光集中在是否可以实现工程化心肌组织中终末分化的心肌细胞恢复再生能力的研究上。他们发现使用终末分化心肌细胞可以在体外构建具有节律性收缩的心脏组织且已经成为一个值得关注的研究问题，然而在这个过程中心肌细胞经历了怎样的发育过程并实现了心肌组织的重塑呢，这个科学问题还需要进一步讨论。

在传统意义上认为哺乳动物的心肌细胞是终末分化的细胞，且基本没有增殖能力，其不能进入细胞周期进而不能通过去分化和再分化的过程恢复完整的功能。但新近研究表明，斑马鱼的心肌细胞在其发育的整个阶段可以保持增殖潜力，成年斑马鱼可以在部分手术切除高达20％的心室后实现心脏的完全恢复，甚至发现心肌细胞可通过去分化促进细胞再进入周期实现细胞增殖。类似研究也表明，心肌去分化的现象也发生在心肌梗死边界区。

与体内生理病理条件相比，模拟体内三维微环境，体外构建的工程化心肌组织确实在心肌组织重建中具有特殊意义。过去我们实验室，已开展了大量的工程化心肌组织构建的研究，已成功构建了利用新生大鼠心肌细胞与胶原/matrigel混合的心肌组织。胶原和基质胶是常用的天然材料用于组织工程，它们是心肌组织工程构建中重要的支架材料。然而，基于胶原/matrigel构建的心肌组织中是心肌细胞如何发育，是否同样存在心肌细胞的分化与去分化现象尚未有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种工程化心肌组织中心肌细胞去分化重塑的方法。

一种工程化心肌组织中心肌细胞去分化重塑的方法，包括如下步骤：

(1)取哺乳动物肌腱，剪碎，溶于醋酸溶液中,12000rpm/4℃离心后取上清，制成ⅰ型胶原；

(2)将ⅰ型胶原，基质胶matrigel，dmem溶液混合，并用naoh溶液调为中性，制成混合物；

(3)取哺乳动物的心肌细胞，与步骤(2)制备的混合物混合，接种到孔板中，在的培养箱中预培养0.5-1h后，添加培养基，培养至心肌重塑形成。

所述醋酸溶液的质量分数为1％；所述ⅰ型胶原的浓度为2mg/ml。

所述ⅰ型胶原，基质胶，dmem的质量比为5:4:1；所述dmem溶液的质量浓度为0.1-10％。

所述naoh溶液的浓度为0.1m。

所述哺乳动物的心肌细胞的细胞密度为2-9×10⁶cells/ml。

所述孔板为12孔板，接种量为每孔1ml。

所述培养箱的培养条件为37uc/5％co2。

所述培养基的成分包括85wt％高糖dmem和15wt％fbs。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明以胶原/基质胶为支架材料，新生sd大鼠心肌细胞为种子细胞，体外构建了工程化心肌组织。利用免疫荧光染色的方式，对eht中巨噬细胞的变化规律做了初步探讨，结果显示，cd206阳性细胞数逐渐增加而cd86阳性细胞数则逐渐降低。本发明的方法将工程化心肌组织中心肌细胞去分化并且重塑，深入阐明心肌细胞的再生机制并提高eht的构建质量。

附图说明

图1是本发明的大鼠心肌细胞培养3天的eht中心肌细胞发生去分化电镜图。

图2是tem分析工程化心肌组织中心肌细胞的重塑电镜图。

图3是培养第10天ehts中发生重塑的心肌细胞形态学特征电镜图。

图4为平面培养的细胞图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

一种工程化心肌组织中心肌细胞去分化重塑的方法，包括如下步骤：

(1)取成年sd大鼠鼠尾肌腱，剪碎，溶于1％的醋酸溶液中，12000rpm/4℃离心后取上清，制备2mg/ml的ⅰ型胶原；

(2)将胶原，基质胶matrigel，dmem溶液按质量比5:4:1混合，并用0.1m的naoh调为中性，制成混合物；所述dmem溶液的质量浓度为1％。

(3)取sd大鼠的心肌细胞，按8×10⁶cells/ml细胞密度与上述混合物混合，接种到12孔板中，每孔1ml，在37uc/5％co2的培养箱中预培养0.5-1h后，添加培养基(85wt％dmem高糖+15wt％fbs)。

实验结果：

(1)培养3天的eht中心肌细胞发生去分化

通过h&e染色显示出胶原/基质胶中的心肌细胞的形态特征。如图1a所示，在h&e染色切片中观察到新生大鼠心肌细胞逐渐丧失其形态特征，且大量心肌细胞在培养时呈椭圆形，细胞核偏向一侧。为了进一步观察心肌细胞在体外三维环境中去分化的程度，使用透射电子显微镜(tem)分析了eht中心肌细胞的显微结构(见图1中的c)。结果表明，在培养早期可以观察到心肌细胞的去分化现象。在培养3天的eht中，心肌细胞的细胞质中释放出肌原纤维；且与正常的心肌细胞相比z带结构和周围肌节逐渐消失。同时，心肌细胞释放出大量的肌原纤维，通过胞吐进入细胞外基质，释放的肌原纤维环绕在心肌细胞周围。同时，我们利用免疫荧光检测α-平滑肌-肌动蛋白(α-sm-a)的表达情况，结果显示工程化心肌组织中有α-sm-a阳性表达的心肌细胞，间接说明发生了心肌细胞发生了去分化现象(见图1中的b)。

(2)tem分析工程化心肌组织中心肌细胞的重塑

当心肌细胞发生去分化后，继续培养至第七天，利用tem观察心肌细胞在eht条件下的超微结构。结果显示：随着心肌细胞逐渐培养，去分化的心肌细胞在另一侧开始形成新的细胞质，同时启动了心肌细胞的重塑(见图2中的a)。在培养第7天可以观察到幼稚的心肌细胞。此时，我们发现心肌细胞经历了新的表型变化。细胞显示不成熟的形态和不规则的轮廓，发生了较短的延伸，围绕核周围发生肌节重组，且可以清晰的观察到z带及h带。发生重塑的心肌细胞中存在许多线粒体和肌节丝(图2中的b)。此外，在个别心肌细胞间形成细胞内连接，且透射电镜结果可以清晰的观察到心肌细胞边缘有类囊泡物质与细胞膜相连(图2中的c)。虽然在细胞质中有新的肌节细丝组装，但仍然缺乏标志性的横向和纵向肌节结构。

(3)培养第10天ehts中发生重塑的心肌细胞形态学特征

培养10天后，采用h&e染色可以清晰的观察到典型的心肌细胞形态特征，细胞呈长梭形(见图3中的b)，这些具有再分化表型的心肌细胞的比例增多，但也同时发现ehts中分布于胶原/基质胶边缘的心肌细胞再分化程度与分布于中心的心肌细胞再分化程度不同，心肌细胞结构特征不清晰(见图3中的a)。透射电镜显示心肌细胞的表型开始改变并且呈现极性。在细胞外基质中发现大量的线粒体和肌原纤维(见图3中的d)。它们可能为心肌细胞再分化提供能量基础。再分化心肌细胞呈现不连续的轮廓，虽然心肌细胞仍然不成熟，细胞轮廓和肌丝的形态接近正常心肌细胞的形态(见图3中的c)。我们还可以观察到材料(胶原/matrigel)和细胞膜之间的连接(见图3中的d)。我们同样发现不是所有的去分化心肌细胞都可以经历再分化过程从而实现心肌细胞重构，但扫描电镜结果已可证实工程化心肌组织中心肌细胞经历去分化和再分化的过程恢复再生能力。

在发现ehts中心肌细胞去分化及重塑发生的同时，发明人检测了其中巨噬细胞的标记物cd206，cd86，cd68的变化规律。结果显示，在培养初期，ehts中有少量cd206的表达，但cd86表达较多。这意味着培养3天的eht发生炎症反应。同时，随着培养天数的增加，cd206的阳性细胞数量有显著增加，发明人分析，cd206阳性细胞可能有利于心肌细胞的再分化；相反，cd86阳性细胞数逐渐减少，暗示心肌细胞再分化过程中炎症反应减少。直到培养第14天，cd206阳性数量与第3天和第7天比最多，但几乎不存在cd86的表达。期间，cd68阳性细胞数变化不明显。

发明人也发现，平面培养的细胞中同样有巨噬细胞的表达，其中除cd86阳性细胞数随着培养天数的增加逐渐减少外，cd206及cd68阳性细胞数的变化并不明显(图4)。

本发明在体外构建工程化心肌组织，通过阐述工程化心肌组织中心肌细胞是否发生去分化进而实现心肌细胞的重塑，并最终恢复增殖能力，以期为构建高质量心肌组织，探讨心脏再生机制提供理论依据。本发明以胶原/基质胶为支架材料，新生sd大鼠心肌细胞为种子细胞，体外构建了工程化心肌组织。采用h&e染色，透射电镜及免疫荧光检测手段证实了在培养第3天，心肌细胞发生去分化，观察到细胞核偏向一侧，肌原纤维被释放出胞质。培养7天后，心肌细胞开始表现出幼稚的细胞形态，并在核周围逐渐重新形成肌节。在培养第14天天，再分化表型的心肌细胞比例增加。进一步采用实时定量pcr，免疫荧光染色检测了工程化心肌组织中心肌细胞特异性标记物的变化规律。结果表明α-actinin及ctnt随着培养天数的增加先降低后升高，而心肌细胞特异性转录因子(gata4/nkx2.5)则随着培养时间的延长升高后降低。利用免疫荧光染色的方式，对eht中巨噬细胞的变化规律做了初步探讨，结果显示，cd206阳性细胞数逐渐增加而cd86阳性细胞数则逐渐降低。本发明阐述了工程化心肌组织中心肌细胞的去分化及重塑现象，在深入阐明心肌细胞的再生机制并提高eht的构建质量方面发挥巨大潜能。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。