本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用。
背景技术：
：浙贝母为道地药材“浙八味”之一，具有润肺止咳的功效，用药历史悠久。贝母品种较多，除了浙贝母外，贝母主要品种还包括川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母，另外流通领域还存在较多贝母伪品。不同品种的贝母药效差异显著，而且价格相差较大，需要建立一种准确、高效的鉴定方法。目前，较多学者利用rapd技术对浙贝母及其它药材进行分子鉴定，但是由于rapd实验应用的是随机引物，导致实验结果重复性差，无法推广应用。中药的基源鉴定是中药研究工作的基础和关键。品种混乱现象是目前贝母类药材在实际应用中较难以克服的问题，而传统的鉴别方法又有一定的主观性，特别是对一些开花前的新鲜贝母药材、干燥或破碎药材，鉴定时更为困难，不仅如此，贝母属植物种间的化学成分差异较大，用理化方法鉴定时也比较困难。核糖体dna的内转录间隔区基因与5srdna转录间隔区基因是目前研究中应用较多的序列片段之一，是被子植物进化研究中重要的dna分子标记。针对目前贝母类药材基源混乱，部分资源短缺的状况，为了建立有效的鉴别方法，同时了解贝母属植物的种系关系，并从中寻找出可利用的药用贝母资源，对贝母的样品进行高效、准确的分子鉴定尤为重要。技术实现要素：本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种适用于浙贝母，且能够特异性识别浙贝母的基因片段，准确、快速进行贝母品种区分的方法，本发明提供了一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用。技术方案：一种用于鉴定浙贝母的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。优选的，所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。表1引物对及发卡结构序列名称序列(5’-3’)seqidno.p1-fggacagtactgggggagaagtc1p1-rgccaaatggagggtatgtgtcg2p2-fcgtaacaaggtttccgtaggtgaa3p2-rttattgatatgcttaaactcagcggg4p3-fggatccgtgcttgggcgagagtagta5p3-rggatccttagtgctggtatgatcgca6发卡结构cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。优选的，所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为：(1)提取浙贝母样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～1000倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。优选的，所述浙贝母样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。优选的，所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。有益效果：(1)本发明所述引物对能够直接对单一样品进行鉴定，因此该方法操作简单、准确、应用范围广等优点；(2)本发明所述引物对特异性好，结果重复性好，灵敏度高，适合开发成检测试剂盒。附图说明图1是实施例1～3pcr鉴定结果电泳图；其中m为分子量为2000的maker；1为实施例1pcr产物鉴定结果；2为实施例2pcr产物鉴定结果；3为实施例3pcr产物鉴定结果；4～7为市售其他品种贝母。具体实施方式实施例1一种用于鉴定浙贝母的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为：(1)提取浙贝母样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释1000倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述浙贝母样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。实施例2一种用于鉴定浙贝母的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为：(1)提取浙贝母样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述浙贝母样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。实施例3一种用于鉴定浙贝母的引物对，所述引物对及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物对p1、p2和p3的上游引物的5’端加上特异性的gc发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为seqidno.7。所述引物对在制备鉴定中药浙贝母试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：引物对、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反应缓冲液。所述试剂盒鉴定中药浙贝母的步骤为：(1)提取浙贝母样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述浙贝母样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。其余品种无扩增条带。sequencelisting<110>苏州市李良济健康产业有限公司<120>一种用于鉴定浙贝母的引物对及其应用<130><160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1ggacagtactgggggagaagtc22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2gccaaatggagggtatgtgtcg22<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3cgtaacaaggtttccgtaggtgaa24<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列<400>4ttattgatatgcttaaactcagcggg26<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列<400>5ggatccgtgcttgggcgagagtagta26<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<400>6ggatccttagtgctggtatgatcgca26<210>7<211>40<212>dna<213>人工序列<400>7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40当前第1页12