一种利于苹果愈伤的苹果MdARF5基因及其应用的制作方法

本发明涉及一种利于苹果愈伤的苹果mdarf5基因及其应用，属于分子生物学
技术领域：
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背景技术：
：铝离子对植物具有毒害作用，是植物生长的主要限制因子。铝胁迫下植物通过根分泌有机酸螯合根际活性铝是其一种抗铝离子胁迫的主要方式。近几十年来，我国苹果产业中由于过量施氮，导致土壤酸化，在酸性土壤中,铝离子被活化，易被植物吸收利用，从而抑制了果树的生长发育，降低了园艺产品食用的安全性。因此，亟待研究植物提高铝离子胁迫抗性的机理，对于果树的抗性和品质起到关键作用。最近研究表明，h+-atp酶活性提高有助于有机酸的外泌，进而抑制铝离子的吸收，ahas属于一类h+-atp酶，它们在有机酸分泌和铝离子抗性方面起到重要作用，前期研究也发现，生长素信号在调控有机酸外泌上也发挥重要作用，但是其机理不清楚。我们在研究过程中克隆了苹果mdarf5基因，研究表明了mdmiel1响应多种激素信号和胁迫响应，过量表达mdmiel1提高了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥的抗盐和抗旱能力。我们的研究发现，苹果mdarf5能够促进aha基因表达，提高h+-atpase活性，进而增加了根系中有机酸的外泌，最终提高苹果愈伤对铝离子胁迫的抗性。技术实现要素：本发明首次通过植物基因工程技术改善植物抗盐、抗旱性和其他有益生产性状，从苹果组培苗中分离克隆出的抗逆相关基因完整编码区段的dna片段，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后转基因植株抗盐和抗干旱能力明显提高。本发明的目的之一，是提供一种利于苹果愈伤的苹果mdarf5基因。本发明的申请人从苹果中分离克隆出的抗盐相关基因完整编码区段的dna片段，并命名为mdarf5。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种利于苹果愈伤的苹果mdarf5基因，所述mdarf5基因的核苷酸序列如seq.id.no.1所示。在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步，所述mdarf5基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq.id.no.2所示。本发明的目的之二，是提供上述利于苹果愈伤的苹果mdarf5基因的操作方法。本操作方法的技术流程成熟，适合产业化应用。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种利于苹果愈伤的苹果mdarf5基因的操作方法，包括以下步骤：(1)提取苹果组培叶片中的rna及反转录；(2)cdna全长序列的获得：根据ncbi查到的苹果愈伤中miel1基因保守氨基酸序列，设计兼并引物mdarf5-f、mdarf5-r，然后以反转录合成的苹果基因组cdna为模板进行pcr扩增，得到cdna全长序列；其中，mdarf5-f序列如seq.id.no.3所示，mdarf5-r序列如seq.id.no.4所示；(3)pcr产物进行回收、载体连接、转化、测序，即得到所述苹果mdarf5基因。在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步，步骤(2)中，所述pcr扩增的反应体系为：pcr反应程序为94℃预变性5min；循环参数为94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸90s，进行32个循环；72℃充分延伸10min。本发明的目的之三，是提供上述利于苹果愈伤的苹果mdarf5基因在转基因苹果愈伤中的应用。本发明的申请人利用强启动子(花椰菜花叶病毒35s启动子)驱动原理的转基因技术，将mdarf5基因的超量表达载体转入苹果愈伤中，从而获得转基因植株。实验证明，超量表达mdarf5基因的转基因苹果愈伤在盐和干旱胁迫下，死亡率相比于野生型明显降低，说明mdarf5基因在植株抗逆中发挥重要作用。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种如上所述的利于苹果愈伤的苹果mdarf5基因在转基因苹果愈伤中的应用。本发明的有益效果是：1.本发明首次通过植物基因工程技术改善植物抗盐、抗旱性和其它有益生产性状，从苹果组培苗中分离克隆出的抗逆相关基因完整编码区段的dna片段，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后转基因植株抗盐和抗干旱能力明显提高。2.本发明的利于苹果愈伤的苹果mdarf5基因的操作方法的技术流程成熟，适合产业化应用。3.本发明的利于苹果愈伤的苹果mdarf5基因可以应用在转基因苹果愈伤中，mdarf5基因在植株抗逆中发挥重要作用。附图说明图1为mdarf5转基因苹果愈伤对铝离子胁迫抗性表型观察图。其中，a和b为表达分析实验验证mdarf5对外界铝离子胁迫的表达响应；c为生长10天的野生型苹果愈伤(wt)和转基因苹果愈伤(l1，l2)生长曲线观察；d为转基因苹果愈伤与野生型苹果愈伤相比，在al3+胁迫下生长速率更快。图2为苹果愈伤转mdarf5基因提高h+-atp酶活性图。其中，a为mdarf5转基因苹果愈伤酸化实验；b为苹果愈伤转mdarf5促进苹果h+-atp酶活性。具体实施方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例1：苹果mdarf5基因的克隆一、嘎啦组培叶片rna提取及反转录1、利用ctab法提取总rna：(1)取1.5g经200mmnacl盐处理24小时的嘎啦苹果组培苗，放入预冷的研钵，加液氮磨碎，转入预冷的50ml离心管中；(2)迅速加入10ml预热到65℃的提取缓冲液(其中pvp和巯基乙醇现用现加)，轻轻混匀，65℃水浴中0.5小时，其中提取缓冲液组成见表1；表1提取缓冲液ctab20％(w/v)tris-hcl0.1mmol/ledta25mmol/lnacl2mmol/l巯基乙醇2％(w/v)pvp2％(w/v)rnasefreeddh2o定容到100ml(3)加入与上步离心管液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡0.5小时，4℃、12000rpm离心20分钟；将上清液转移到新的50ml离心管中；(4)加入1/3上清液体积的10mol/l预冷licl，-20℃放置3小时，12000rpm离心30分钟，弃上清液；(5)加入500μlsste缓冲液充分悬浮沉淀后，平均分装到2支1.5ml离心管中，其中sste缓冲液组成见表2；表2sste缓冲液nacl1mmol/lsds0.5％(w/v)edta10mmol/lrnasefreeddh2o定容到10ml(6)分别加入与悬浮液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振荡10分钟，4℃、12000rpm离心10分钟，将上清液转移到新的1.5ml离心管；(7)分别加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合物，冰浴振荡10分钟，4℃、12000rpm离心10分钟，将上清液转移到新的1.5ml离心管；(8)加入2.5倍上清液体积的预冷无水乙醇，-20℃放置1-2小时；(9)于4℃、12000rpm离心20分钟，70％乙醇洗2次；(10)于4℃、14000rpm离心10分钟，超净台上风干沉淀；加入20μldepc水溶解rna；(11)置-80℃储藏,备用,或立即进行以下反转录实验。2、反转录cdna第一链的合成(1)在0.2ml的微量离心管中配制表3混合液(其中表3中rna为步骤1提取获得的；如果用的是-80℃储藏rna，必须让其在冰上缓慢融解)：表3混合液rna2μgoligo(dt)primer(50μm)1μldntpsmixture(10mmeach)1μlrnasefreeddh2o定容到10μl(2)用枪头轻轻混匀，将微量离心管放在pcr仪上(65℃,5分钟)进行变性、退火反应，然后冰上急冷；(3)在上述微量离心管中继续配制表4反转录反应液；表4反转录反应液上述变性、退火后反应液10μl5×primerscripttmbuffer4μlrnaseinhibitor(40u/μl)0.5μlprimerscripttmrtase(200u/μl)1μlrnasefreeddh2o4.5μl共计20μl(4)在pcr仪上按下列条件进行反转录反应：30℃，10分钟；42℃，60分钟；70℃，15分钟；4℃保存。合成的反转录产物cdna，用于进行后面的相关实验。3、cdna末端加尾利用tdt末端转移酶，步骤2中反转录合成的cdna3’末端加上poly(c)尾巴，以此为模板进行5’race扩增。在1.5ml离心管中依次加入表5所示的pcr反应试剂，终体积为50μl。表5pcr反应试剂纯化cdna产物25μl5×tdtbuffer10μl0.1％bsa5μl10mmol/ldctp(终浓度0.5mmol/l)2.5μltdt15uddh2o定容到50μl(1)37℃反应30分钟；(2)加入50μl(等体积)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀；离心，取上层(水层)至另一新的1.5ml离心管中；(3)加入50μl(等体积)的氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀；离心，取上层(水层)至另一新的1.5ml离心管中；(4)加入5μl(1/10体积)3mnaac(ph5.2)，再加入125μl(2.5倍体积)预冷的无水乙醇，-20℃放置30-60分钟；(5)4℃、12000rpm离心15分钟，70％乙醇洗2次；(6)4℃、12000rpm离心10分钟，超净台上风干沉淀；用20μl无菌水溶解dna，4℃保存，获得的加尾cdna作为模板用于后面的5’race扩增。二、cdna全长序列的获得根据ncbi查到的苹果愈伤中miel1基因保守氨基酸序列，设计兼并引物(mdarf5-f,mdarf5-r)，以反转录合成的cdna为模板进行pcr扩增。mdarf5-f：5’-atgatgggttcggtgga-3’，其序列如seq.id.no.3所示；mdarf5-r：5’-ttagggacggccaccctc-3’，其序列如seq.id.no.4所示；其中，pcr扩增体系见表6。表6pcr扩增体系10×pcr含mg2+的buffer2.5μl2.5mmol/l的dntp2.0μl10μmol/l引物mdarf5-f1.0μl10μmol/l引物mdarf5-r1.0μlcdna或基因组dna模板1.0μltaq酶0.2μlddh2o定容至25.0μlpcr反应程序为94℃预变性5min；循环参数为94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸90s，进行32个循环；72℃充分延伸10min。pcr反应结束后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳以检测是否有适当大小的条带，并将pcr产物回收(回收根据takara公司“agarosegeldnapurificationkit”操作)、载体连接(取3.0μlpcr回收产物与pmd18-t载体连接，操作步骤按pmd18-tvector说明书进行)、转化(连接产物转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，在表面涂有iptg/x-gal的lb平板培养基上，37℃倒置培养12-20小时；挑取白色菌落，在lb液体培养基中培养过夜)、序列测定(将摇好的菌取1ml放到1.5ml离心管中，密封，在北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定后，得到mdarf5基因)，其核苷酸序列如seq.id.no.1所示；其氨基酸序列如seq.id.no.2所示。实施例2：转基因苹果愈伤的获得1)挑取农杆菌单克隆菌落接种于10mlyep液体培养基(含50mg/l潮霉素)中，28℃、200rpm，振荡培养至od600为06-0.8(约48h)。取其中1ml菌液加入20mlyep液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至od600为06-0.8(约5h)。离心收集菌体，ddh2o稀释，配制侵染液。2)取生长状态良好的野生型苹果愈伤组织，将愈伤组织置于侵染液中静置孵育30min。吸收纸吸干后，预培养1天。3)将预培养1天后的苹果愈伤平铺到选择性培养基(100mg·l-1hyg)上培养1-2月。4)通过基因检测筛选转基因愈伤组织。实施例3：转基因苹果愈伤的al离子胁迫抗性观察使用生长3周左右、长势良好的苹果组培幼苗，用不同浓度的al3+处理，表达分析实验验证mdarf5对外界铝离子胁迫的表达响应，表达分析结果发现，al3+明显促进mdarf5基因表达。同时将mdarf5遗传转化苹果愈伤组织，在al3+胁迫下处理苹果愈伤，观察生长曲线，结果表明，转基因苹果愈伤与野生型苹果愈伤相比，在al3+胁迫下生长速率更快，如图1所示。3、mdarf5转基因苹果愈伤提高将继代培养两周左右、长势良好的苹果mdarf5和野生型愈伤，在含有ph染色试剂的继代培养基上生长48h，观察培养基h+外泌现象，结果发现，过表达mdarf5明显促进了h+外泌，为进一步证明这一结果，同时检测了mdarf5转基因愈伤和野生型愈伤的，结果进一步证实，过表达mdarf5促进了h+-atp酶活性，如图2所示。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表〈110〉山东农业大学〈120〉一种利于苹果愈伤的苹果mdarf5基因及其应用〈160〉2〈170〉patentinversion3.5〈210〉1〈211〉2691〈212〉dna〈213〉苹果〈400〉1atgatgggttcggtggaggagaagctcaaaactggatgcttgcttgatgagatgaagctgctgaaagagctgcaggaccactctgggacccggaaggctataaattcggagctatggcacgcttgcgccggcccgcttgtttgcttgccgcaggttgggagtctctcgtactacttcccccaaggacatagcgaacaggtggcggtttcgacgaaaagaacggcaacctcacaaattccgaactatcccaatctcccttctcagttgctatgccaagttcaaaatgttacactgcatgcagacaaagaaaccgacgaaatctatgcacaaatgagccttaaaccagtgagctctgaaagggatgtcttcccggtaccggactttggaatgaggcctagtaaacatccatctgagtttttctgcaaaactttgactgcaagtgacacaagcacacatggagggttctccgtgccgcgtagggcagcggaaaagctctttcctccgctggatttcacaatgcagccaccaacccaagaacttgttgtccgagacttgcacgataatacctggacatttcgccacatttatcgcgggcagccgaaacgacaccttctcacaactggatggagtttgtttgttggtgcaaagaggcttagagcaggggattccgttctatttatcagggatgagaagtcgcagctattgatcggtgtgagacgagcaaatcgtcagcaaacaacattgccgtcatcagttctatctgctgatagcatgcacattggtgtccttgctgctgcggctcatgctgcagctaatcggagtccattcactatattctacaatccaagggcatgcccttcagaatttgtcatacctttggccaccttccaaaaggctgtatttgggacacagctctcgattggcataaggtttggaatggtgttcgagacagaggagtcgggcaagcgcagatatatgggcacgatagttggtattagtgatttagatccgctgagatggcctggttcaaaatggcgaaatcttcaggtagagtgggatgagccagggtgttgtgataaacagaacagggttagttcatgggaaatcgaaactccggaaagtcttttcatatttccttctctgacttcgagtcttaaaagaccgatgcactctggattcttgggagcagaaaccgaatggggaaatatgaccaaaagatcattcatccgggttcctgagattggaaacgggaactcttttccatacccgatttcaaatctatgttcggaacagctagtcaatatgctaatgaaacctcagcttgttaatcatgctggaacattagctactctacaacaggaatcggctgctaatgtagattcagtagatatgaaggccatgcaggccaaaatcaaccaaaagaatccagctgatggtgtaaacgcgaatgcaccatctcatggaattccaccgggaaatctgaacaccgtagccaagtttggaagccaagcaccagttggaagtagcactgagaagatgaaatcagaacctgaactttctgcagatcagttaagtcagttgagttcggcagggcaaggcatcgaggataaattagctgcagggtttgcgagtccctataaccttatgaatcagctgacatttgccaaccaaaaccccagttcagcgcaactacaaactagtccgcggcctatgcagcctttggattcactactctaccactctcaacaaactgaattacctcattcggatttcaatggcatgaacagttcacttccattcctagacaatgatgaatgcatgttttactcttcttgcctacctttttctggggcactcagatcaccgggtcctttgtctgctttcggtttaccagattcttcaactgttttaactgacgcaaatacttcctccctaacttcaatcggtcaggacatgtgggataatagcctcattaattcaagcagcctgagagatttgtcggatgagagcaacaatcaaagtgggatctacggctgtccgaacattgatgttggtagctgcttaagtactgtcgtcgacccttctgtctcaagcactatactcgatgacttctctacgctgaagaatgccaacttccagaattcttcggattgtttggttaaaaacttgagctcaagccaggatcttcagtcgcagattacctcggtgagccttggagactctcaggctttctctaggcaagacctggcagacgcctcaggcggtacatcctcgagcaatgtagaacttgatgagagcagtctactgcagaacagttcgtggcatccggtggttgcacctgtgcgaacctacacaaaggttcaaaagacgggatctgttgggcggtcaattgatgttactaatttcaaaaactacgaagaactatgctctgcaatcgaatgcatgttcggactggaagggctgctaaatgatccaagaggttcagggtggaaattggtttatgtagattatgagaacgacgttctacttgtcggggatgatccttgggaggaatttgttggttgtgtccgctgcatcagaatcctttcgcctactgaagttcagcagatgagcgaagaaggcatgaagcttctgaacagtgctgcgatgcaagggatgaatagcaccatgtccgagggtggccgtccctaa2691〈210〉2〈211〉896〈212〉prt〈213〉苹果〈400〉1mmgsveeklktgclldemkllkelqdhsgtrkainselwhacagplvclpqvgslsyyfpqghseqvavstkrtatsqipnypnlpsqllcqvqnvtlhadketdeiyaqmslkpvsserdvfpvpdfgmrpskhpseffcktltasdtsthggfsvprraaeklfppldftmqpptqelvvrdlhdntwtfrhiyrgqpkrhllttgwslfvgakrlragdsvlfirdeksqlligvrranrqqttlpssvlsadsmhigvlaaaahaaanrspftifynpracpsefviplatfqkavfgtqlsigirfgmvfeteesgkrrymgtivgisdldplrwpgskwrnlqvewdepgccdkqnrvssweietpeslfifpsltsslkrlmhsgflgaetewgnmtkrsfirvpeigngnsfpypisnlcseqlvnmlmkpqlvnhagtlatlqqesaanvdsvdmkamqakinqknpadgvnanapshgippgnlntvakfgsqapvgsstekmksepelsadqlsqlssagqgiedklaagfaspynhmnqltfanqnpssaqlqtsprpmqpldsllyhsqqtelphsdfngmnsslpfldndecmfyssclpfsgalrspgplsafglpdsstvltdantssltsigqdmwdnslinssslrdlsdesnnqsgiygcpnidvgsclstvvdpsvsstilddfstlknanfqnssdclvknlsssqdlqsqitsvslgdsqafsrqdladasggtsssnveldessllqnsswhpvvapvrtytkvqktgsvgrsidvtnfknyeelcsaiecmfglegllndprgsgwklvyvdyendvllvgddpweefvgcvrcirilsptevqqmseegmkllnsaamqgmnstmseggrp896当前第1页12