本发明涉及基因检测技术领域，具体是一种基于定量pcr技术的gstt1分型检测方法。
背景技术：
gstt1为一种重要的代谢酶，参与对内生和外源性物质的转化和代谢，赋予代谢物新的生物学特性。在人类gstt1具有多态性，gstt1缺失为一种常见的基因型。不同gstt1基因型的个体地物质的转化功能存在差异。gstt1基因分型用于多种生物学性状的研究。传统的，由于gstt1缺失多态性可以通过普通pcr检测，多采用常规基因特异性pcr，琼脂糖电泳检测方式确认gstt1基因型。虽然简便，但是由于电泳操作必须开管加样和电泳，容易造成实验室污染，难于在高通量下确保实验可靠性。同时常规pcr电泳分析法也难于发现杂合子基因型，影响基因性状分析的准确定。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种避免有毒dna染色剂污染、提高检测通量的基于定量pcr技术的gstt1分型检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于定量pcr技术的gstt1分型检测方法，具体步骤如下：
（1）采用二代测序验证的人gstt1正常纯合子、杂合子和缺失纯合子基因组dna作为相应对照物；
（2）采用gstt1基因特异性的引物seq1和seq2扩增gstt1基因片段，同时在gstt1基因特异性的引物界定的扩增区域内设计gstt1基因特异性taqman探针seq3-fam；若存在gstt1基因，则gstt1基因特异性taqman探针seq3-fam释放fam荧光信号而被定量pcr仪器检到；若没有gstt1片段，则无gstt1扩增，无fam荧光信号释放；
（3）采用albumin特异性的pcr引物seq4和seq5扩增albumin基因片段，同时在albumin基因特异性的引物界定的扩增区域内设计albumin基因特异性taqman探针seq6-vic；若存在合格样本，则有albumin扩增，释放vic荧光信号，定量pcr仪器检测到vic荧光信号；若样本不合格，则样本无albumin扩增，无vic荧光信号释放；
（4）对比扩增fam/vic信号确认待检测样本基因型；
所述引物seq1的核苷酸序列号如下：tctgtggtccccaaatcaga；
所述引物seq2的核苷酸序列号如下：ctgtggggaaaagggtacag；
所述gstt1基因特异性taqman探针seq3-fam的核苷酸序列号如下：
vic-5´-tgctgcccatccctgccctcacaacca；
所述引物seq4的核苷酸序列号如下：5´-actccaaacctgatgcttct-3´；
所述引物seq5的核苷酸序列号如下：5´-ccttagggcagaattatcca-3´；
所述albumin基因特异性taqman探针seq6-vic的核苷酸序列号如下：
fam-5´-cagcctgttgccccttttagagttcctttt-3´。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤（1）中人gstt1正常纯合子、杂合子和缺失纯合子基因组dna的浓度为10ng/μl。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用基于taqman探针的定量pcr实现闭管一次检测确定gstt1基因拷贝数的目的，解决了常规gstt1检测需要pcr后开管电泳，而容易引起实验室内pcr产物污染，难于高通量稳定获得准确基因分型结果的问题，同时简化了pcr检测方法，防止电泳检测方法的操作过程复杂、存在潜在dna染料等环境污染危险以及人为结果误判的可能；可以有效预防pcr产物污染，避免有毒dna染色剂污染，可以大大简化检测与结果分析过程，提高检测通量；另外，本发明也建立一种定量机制，提供鉴定发现杂合子的技术路线。
附图说明
图1为本发明实施例中albumin基因扩增和gstt1特异性片段扩增曲线示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1，一种基于定量pcr技术的gstt1分型检测方法，具体步骤如下：
（1）采用二代测序验证的浓度为10ng/μl的人gstt1正常纯合子、杂合子和缺失纯合子基因组dna作为相应对照物；
（2）采用gstt1基因特异性的引物seq1和seq2扩增gstt1基因片段，同时在gstt1基因特异性的引物界定的扩增区域内设计gstt1基因特异性taqman探针seq3-fam；若存在gstt1基因，则gstt1基因特异性taqman探针seq3-fam释放fam荧光信号而被定量pcr仪器检到；若没有gstt1片段，则无gstt1扩增，无fam荧光信号释放；
（3）采用albumin特异性的pcr引物seq4和seq5扩增albumin基因片段，同时在albumin基因特异性的引物界定的扩增区域内设计albumin基因特异性taqman探针seq6-vic；若存在合格样本，则有albumin扩增，释放vic荧光信号，定量pcr仪器检测到vic荧光信号；若样本不合格，则样本无albumin扩增，无vic荧光信号释放；
（4）对比扩增fam/vic信号确认待检测样本基因型；
所述引物seq1的核苷酸序列号如下：tctgtggtccccaaatcaga；
所述引物seq2的核苷酸序列号如下：ctgtggggaaaagggtacag；
所述gstt1基因特异性taqman探针seq3-fam的核苷酸序列号如下：
vic-5´-tgctgcccatccctgccctcacaacca；
所述引物seq4的核苷酸序列号如下：5´-actccaaacctgatgcttct-3´；
所述引物seq5的核苷酸序列号如下：5´-ccttagggcagaattatcca-3´；
所述albumin基因特异性taqman探针seq6-vic的核苷酸序列号如下：
fam-5´-cagcctgttgccccttttagagttcctttt-3´。
本发明基于基因特异性pcr结合taqman探针判断基因片段存在时学界一致认为可靠的技术方法。采用albumin基因对照扩增也是学界一致认为的提示样本质量和相对定量的参照体系。本发明采用的技术方案采用gstt1特异性的基因扩增和taqman探针，同时采用对照albumin基因对照扩增可以明确gstt1基因分型结果。基于taqman探针定量pcr方法不需要开管电泳，可以有效预防pcr产物污染，避免有毒dna染色剂污染，可以大大简化检测与结果分析过程，提高检测通量。
实施例1
（1）测试用正常人基因组dna制备：采取正常人口腔咽拭子，chlex100抽提制备，正常人基因组dna浓度稀释到10ng/μl；
（2）pcr特异性引物和探针设计合成：根据人gstt1基因序列设计合成基因特异性引物seq1，seq2和gstt1特异性taqman基因探针标记fam；依据人albumin基因设计内参基因特异性pcr引物seq4，seq5和探针seq6标记vic；
（3）gstt1定量pcr检测：
1）引物探针混合物配置：
2）反应体系：引物探针混合物1.5μl，2倍tiantoughgenotypingqpcrpremix(probe)12.5μl，标准模板1.5μl，ddh2o9.5μl。
3）定量pcr仪：abi7500
4）反应条件：95℃、2min；95℃、15s---60℃、32s，42循环。
（4）基因验证结果读取：
参见图1，图1是人gstt1正常检测结果，albumin基因扩增曲线，gstt1特异性片段扩增曲线，横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号。
检测到vic、fam信号确定为扩增成功；样本fam/vic与三个对照样本之一扩增fam/vic比值为3-6，确定为对应对应基因型；无法对应三个样本之一或者对应多个则实验失败.
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。