一种用于细胞荧光显色的水溶性荧光染料的制作方法

技术领域[0001]本发明涉及了一系列可以应用在细胞荧光显色的水溶性荧光染料化合物的合成及其细胞显色功能。

背景技术：

传统的生物检测方法包括放射性同位素标记、显微镜观察法和电化学，但是同位素标记法具有辐射的危险并且随着半衰期的到来，检测信号就会大打折扣；显微镜观察法由于放大倍数的限制不能有效的观察到生物活动的具体过程以及电化学监测易破坏生物样品，这些缺点也就导致了传统的生物检测方法在实际应用中受到了很大的限制。但是与传统的检测方法相比较，荧光分析技术因其具有无危害、分析快速直观、高灵敏性以及操作环境友好等优点成为了现在最为重要的一种生物检测方法，并且具有巨大的实际应用价值。随着科技的发展，荧光分析技术不仅仅应用在小鼠等生物体内，而且可以应用在活细胞中，进行细胞标记，从而进行细胞追踪等研究。

细胞荧光显色图像可以直观的观察细胞形态、结构和生命活动，在生物和医学领域得到了广泛的研究应用，故无毒并且具有良好细胞通透性的细胞荧光染料也逐渐引起了广大研究者的注意。各种各样的有机染料已经被广泛的应用在细胞荧光显色中，但是当细胞不断发生聚集时，传统的有机染料就会发生荧光猝灭，并且很多荧光染料水溶性差，从而无法标记细胞，很大程度上限制了在细胞荧光显色成像的应用，这对细胞的研究存在着巨大的困难。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一类在聚集状态下依然具有很强荧光发射的水溶性四苯乙烯衍生物有机染料，并且该类染料具有很好的细胞穿透性。

本发明另一目的是提供上述四苯乙烯衍生物有机染料的制备方法。

本发明实现过程如下：

结构通式（i）所示化合物，

其中，r1独立地选自或r1不存在；

r2独立地选自-cooh,-opo3h2或-so3h；

n=1-8的整数；

x为卤素的碘或溴离子。

上述化合物的合成方法之一：以二苯甲酮为原料，通过mcmurry反应，溴化反应，suzuki反应以及sn2的取代反应得到；

其中，r2独立地选自-cooh,-opo3h2或-so3h；

n=1-8的整数；

x为卤素的碘或溴离子。

上述化合物的合成方法之二：以二苯甲酮为原料，通过mcmurry反应，溴化反应，heck反应以及sn2的取代反应得到，

其中，r2独立地选自-cooh,-opo3h2或-so3h；

n=1-8的整数；

x为卤素的碘或溴离子。

上述化合物的合成方法之三：以二苯甲酮为原料，通过mcmurry反应，溴化反应，sonogashira反应以及sn2的取代反应得到，

其中，r2独立地选自-cooh,-opo3h2或-so3h；

n=1-8的整数；

x为卤素的碘或溴离子。

上述化合物可应用于细胞荧光显色中。

本发明以四苯乙烯为母核，通过suzuki、heck等简单的偶合反应，以及sn2的取代反应引入水溶性基团，设计合成了一系列新型的水溶性荧光染料化合物，这类化合物具有优良的发光性能，同时又具有水溶性，并且合成路线短，方法简便，具有很强的实用价值。

附图说明

图1为实施例1化合物5的荧光谱图；

图2为实施例2化合物7的荧光谱图；

图3为实施例3化合物7的hela细胞荧光显色图。

具体实施方式

实施例1：（通式中r1不存在）

（1）在n2下，将7.18g的锌粉加入到80ml干燥的thf中，0℃搅拌10mins。在冰浴下，使用注射器将6ml的ticl4缓慢滴加到反应中，加热回流2h。然后，将5g的二苯甲酮（化合物1）溶于20mlthf中，使用恒压滴液漏斗缓慢滴加，加热回流12h。反应结束后，用10%的k2co3溶液猝灭，并使用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗，收集有机相并用无水mg2so4干燥。最后，使用旋转蒸发仪将有机相的溶剂移除，得到的产物用乙醇洗，最终得到3.8g白色固体四苯乙烯。

（2）将（1）得到的四苯乙烯（化合物2）溶解在ch2cl2中，并缓慢加入3ml的br2，在室温下搅拌12h，然后用乙醇，na2s2o3猝灭。用naoh将反应调节ph=7，用ch2cl2提取，有机相用无水mg2so4干燥。最后，选用洗脱剂为石油醚，通过硅胶色谱柱提纯，得到白色产物。

（3）在n2下，将（2）所得的化合物3、679mg的4-吡啶硼酸、162mg的醋酸钯、3.93g的k2co3和204mg的三环己基膦加入到反应管中，再加入30ml的dmf，加热回流48h后，冷却到室温。通过旋转蒸发仪将溶剂移除，用chcl3提取产物，并用水洗，收集有机相，并用无水mg2so4干燥。最后有机相用硅胶色谱柱提纯，洗脱剂为chcl3:meoh=30:1，最终得到淡黄色产物。

（4）将（3）得到的淡黄色化合物4与117.2mgbrch2ch2cooh溶于4mldmf中，加热回流24h。然后，冷却至室温，加入过量的丙酮，收集沉淀，沉淀用丙酮、石油醚洗，真空干燥得到最终化合物5。谱图1说明化合物5具有很强的黄色荧光。

结构分析

mp:233-234°c.ir(kbr,cm-1):3383m,2922s,1717s,1644s,1604s,1531m,1491s,1461m,1409s,1216s,1288m,1167s,1013w,827s,787m,722w.¹hnmr(400mhz,d2o):8.79(d,j=6.9,8h),8.18(d,j=6.9,8h),7.73(d,j=8.1,8h),7.39(d,j=8.1,8h),4.72(t,j=12.9,8h),2.87(t,j=12.9,8h).¹³cnmr(100mhz,cd3od):171.7,155.7,146.4,145.1,132.8,132.4,127.9,127.6,124.0,124.2,118.7,123.6,56.2,33.9.hr-ms:m/z233.0960([c58h52n4o8]⁴⁺,calcd.for[c58h52n4o8]⁴⁺,233.0941。

实施例2：（通式中r1是双键为母核）

（1）在n2下，将化合物3、42mg的醋酸钯、200g的k2co3和44mg的三环己基膦加入到反应管中，再加入10ml的dmf和130g4-乙烯吡啶，加热回流48h后，冷却到室温。通过旋转蒸发仪将溶剂移除，用chcl3提取产物，并用水洗，收集有机相，并用无水mg2so4干燥。最后有机相用硅胶色谱柱提纯，洗脱剂为chcl3:meoh=30:1，最终得到黄色产物6。

（2）化合物6与29mgbrch2ch2cooh溶于1mldmf中，加热回流24h。然后，冷却至室温，加入过量的丙酮，收集沉淀，沉淀用丙酮、石油醚洗，真空干燥得到最终化合物7。图2说明化合物7具有很强的橘红色荧光，图3说明化合物7在细胞中有很好的荧光显色效果。

结构分析：

mp:221°c.ir(kbr,cm-1):3395s,2921s,1728s,1627vs,1591s,1548w,1512s,1461m,1411m,1317w,1167s,973w,836m,785w.¹hnmr(400mhz,cd3od):8.79(d,j=6.9,8h),8.08(d,j=6.9,8h),7.84(d,j=16.3,4h),7.57(d,j=7.7,8h),7.36(d,j=16.3,4h),7.18(d,j=7.7,8h),4.69(t,j=12.6,8h),2.82(t,j=12.6,8h).¹³cnmr(100mhz,cd3od):171.8,154.2,145.4,144.5,141.1,134.2,131.9,127.9,123.6,122.8,55.9,33.4.hr-ms:m/z259.1101([c66h60n4o8]⁴⁺,calcd.for[c66h60n4o8]⁴⁺,259.1097)。

参照实例的合成方法，可制备不同的部分水溶性荧光染料，其结构如下表所示。

注：其他不同碳数的烷基链的荧光染料与以上的合成方法完全一样。

本发明提出了反应条件温和、生产成本低、合成方法高效、光学性质优良并且具有很好的水溶性的荧光染料合成方法，并且为细胞荧光显色方面具有巨大的潜在应用价值。