硅柱快速再生方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体为硅柱快速再生方法。

背景技术：

传统的分子克隆方法费时费力；因此，许多实验方法或技术被商业试剂盒取代，如1)用于pcr产物(或dna)纯化的pcr清洁试剂盒(pcr即聚合酶链式反应是基因或dna扩增的主要手段)，2)用于dna酶切产物纯化的琼脂糖胶抽提试剂盒和3)质粒提取试剂盒。利用这些试剂盒加快了分子克隆的进程和研究的效率。由于试剂盒相对昂贵而且产品的设计主要是一次性使用，试剂盒的使用也耗费了许多实验室的财力。

上述试剂盒主要由硅柱和实验试剂组成，其核心材料是硅柱。一次性使用的试剂盒，一方面，造成大量的垃圾和环境问题，另一方面，也造成资金和资源的浪费。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明提供一种使硅柱快速再生的方法，并对再生的硅柱进行了功能鉴定。

具体技术方案为：

硅柱快速再生方法，包括以下过程：

(1)取硅柱置于收集管中，加0.75ml蒸馏水，进行离心分离，弃去收集管中废液；

(2)向硅柱中加入硅柱再生液，静置3分钟进行离心分离，弃去收集管中废液；所述的硅柱再生液为磷酸溶液；

(3)重复步骤(2)五次；

(4)用0.75ml蒸馏水，离心分离、清洗硅柱，弃去收集管中废液；

(5)将硅柱移至无菌离心管中，离心1分钟，除尽硅柱中残留水分即可得到快速再生的硅柱；

以上所述的离心分离过程为采用台式离心机中，在室温下，以12000rpm速度离心1分钟。

所述的磷酸溶液浓度为1mol/l。

本发明提供的硅柱快速再生方法针对pcr清洁试剂盒中或琼脂糖胶抽提试剂盒中的硅柱进行再生和利用，可以为实验室节约资金，为社会节约资源，是更加环保的使用硅柱的方法。

附图说明

图1为实施例中的标准曲线；

图2为实施例中不同浓度的磷酸对硅柱dna污染清除效果分析；

图3为实施例中再生硅柱与未使用过的硅柱对dna纯化效果比较分析；

图4为实施例中再生硅柱从琼脂糖中回收、纯化dna效果分析；

图5为实施例中再生硅柱多次连续使用对dna纯化效果分析；

图6为实施例中再生硅柱与原始柱对tbox5基因克隆比较分析。

硅柱再生具体实施方式

以下结合多个实验和实施例说明本发明的具体技术方案。

实施步骤一、标准曲线的建立

为了获得再生硅柱，最为关键的技术问题是清除一次性使用过的硅柱中dna污染。为了更好地评估所使用试剂去污染的效果，首先必须建立标准曲线。将人lif基因的dna以1:10方式连续稀释，分别获得浓度为1×10^-2,1×10^-3,1×10^-4,1×10^-5,1×10^-6纳克/微升的dna。将这些不同浓度的dna进行荧光定量pcr(qpcr)分析，将获得qpcr结果与dna浓度的负对数(-log10)作图，结果表明，qpcr的ct值与dna浓度的负对数成正相关，如图1，说明标准曲线已经建立，.标准曲线由ct平均值与dna浓度的负对数绘制而成。

实施步骤二、磷酸对使用过的硅柱进行再生的方法

硅柱是由硅膜和塑料两种材料制成的，对dna起结合作用的是硅膜中的二氧化硅(sio2)，室温下，二氧化硅是比较耐酸碱的化学材料。另外，磷酸核糖骨架支撑dna分子的双螺旋结构。dna中含有大量磷酸基团，磷酸是否可用于清除dna污染并不清楚。本实施步骤将浓磷酸分别稀释不同的浓度，如图2，对使用过的硅柱进行清洗。

具体方法是：1)取5支一次性使用过的硅柱(即5支硅柱已被用于纯化过人类的lif基因的dna片段)并置于2ml收集管中，分别向硅柱中加0.75ml蒸馏水，将硅柱置于台式离心机中，在室温下，以12000rpm速度离心1分钟。2)除去收集管的废液，向硅柱中分别加入0.5ml不同浓度磷酸的硅柱再生液(如图2)，静置3分钟，将硅柱置于台式离心机中，在室温下以12000rpm速度离心1分钟后除去收集管中的废液。3)重复步骤2)五次。4)待磷酸试剂清洗完成，用0.75ml蒸馏水再次清洗一次，弃去收集管中废液。5)最后，将清洗过的硅柱与收集管置于离心机中以12000rpm速度离心1分钟，除尽硅柱中残留水分；至此，硅柱再生步骤完成。

上述步骤完成后，将再生硅柱移至1.5ml无菌离心管中，向硅柱中加入30微升去离子水，以12000rpm的速度离心1分钟并收集、保存洗脱液。为确定何种浓度的磷酸可以更好地再生硅柱，本实施例利用上述洗脱液中dna残留量来分析不同浓度试剂对硅柱中dna污染的清除效果。因此，利用定量pcr(qpcr)方法和实施步骤一中建立的标准曲线，本实施例分析了各洗脱液中dna残留浓度。结果表明，在所测试的试剂中，1mol/l磷酸溶液表现出很好的dna清除效果，洗脱液中dna残留浓度为0.0031pg/μl，如图2；但随着磷酸溶液浓度增加，洗脱液中dna残留浓度下降不是特别明显。可见，1mol/l磷酸足够让使用过的硅柱进行再生。

对再生硅柱的功能鉴定：

实施步骤三、再生硅柱能有效结合与纯化pcr产物(dna)

以上实验证明1mol/l磷酸具有很好地除去硅柱中dna污染的效果；但是，经磷酸清洗过的硅柱是否能与dna结合并有效纯化pcr产物并不清楚，因此，本实施例有必要对再生硅柱的这一功能进行鉴定。本实施例利用再生硅柱以及未使用过的硅柱如axygen和qiagen的原硅柱对pcr产物纯化效果进行分析。这里分析pcr产物t-box5基因的纯化效果。实验过程如下：1)利用pcr在50微升反应体系中扩增t-box5基因，并设置3个重复。2)分别将50微升pcr产物按1:5体积加入dna结合液(250微升)。2)分别将300微升的dna混合液加入三种不同的硅柱中，以12000rpm速度离心1分钟。3)除去管中废液，分别向硅柱中加入600微升硅柱清洗缓冲液，以12000rpm速度离心1分钟。4)除去管中废液后，以12000rpm速度离心1分钟，用1.5ml无菌离心管置换2ml废液收集管，向硅柱中加30微升去离子水，离心收集洗脱液。5)取3微升用于琼脂糖凝胶电泳并进行成像分析。

tbox5基因(1557bp)pcr扩增后，用不同硅柱进行纯化并对纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。如图3所示，qiagen再生硅柱与未使用过的硅柱表现出相似的产量。而再生硅柱比axygen硅柱表现出更高的产量。说明再生硅柱能与pcr产物(dna)结合并能够有效纯化dna。

本实施步骤使用的dna结合液，硅柱清洗缓冲液为qiagen试剂盒中提供的试剂。

实施步骤四、再生硅柱能够有效地于从琼脂糖胶中回收与纯化dna

再生硅柱是否能够从琼脂糖胶回收和纯化dna还不清楚，因此有必要对此功能进行鉴定。dna酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，利用再生硅柱从琼脂糖凝胶中进行回收和纯化，具体方法如下：

1)分别取1微克纯化的pcr产物，利用限制性酶bamhi和ecori进行酶切2小时。2)酶切完成后，将酶切后的样品进行琼脂糖凝胶电泳30分钟。3)将琼脂糖凝胶置于紫外灯下，用手术刀片将dna目的带位置的凝胶切出，置于称量过的1.5ml离心管中。4)将胶和离心管于电子天平中称量每块胶的重量，向离心管中加入3倍胶重量的胶溶解液并置于55℃的水浴锅中溶解。5)待胶溶解后，向离心管中加入1倍胶重量的异丙醇并彻底混合。6)分别将胶混合液移至三个不同的硅柱中(两个新硅柱(axygen,qiagen)和一个再生柱)，以12000rpm速度离心1分钟。7)除去废液，向硅柱中加600微升硅柱清洗液，以12000rpm速度离心1分钟。8)除去废液，将硅柱再次离心1分钟。9)用1.5ml无菌离心管置换2ml废液收集管，向硅柱加30微升去离子水，以12000rpm速度离心1分钟，收集洗脱液。10)各取5微升洗脱样品进行琼脂糖凝胶电泳分析进行成像分析。

tbox5基因扩增后，用bamhi和ecori进行酶切，随后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有目的dna胶切出，利用不同的硅柱从胶中回收、纯化dna。最后，将回收的dna进行琼脂糖凝胶电泳分析。如图4所示，利用qiagen再生硅柱纯化获得的dna量与未使用过的硅柱纯化所获得的dna量差别不大。说明再生硅柱能够从琼脂糖胶中回收与纯化dna。

本实施步骤使用的胶溶解液，硅柱清洗缓冲液为qiagen试剂盒中提供的试剂。

实施步骤五、再生硅柱能反复使用

以上步骤证明了再生硅柱能有效地纯化dna，但这种再生硅柱是否可以反复使用并不清楚。本实验利用再生硅柱多次纯化tbox5基因pcr产物。将使用过的硅柱用1mol/l磷酸按照实施步骤二中描述的方法进行清洗。dna纯化按照实施步骤三中描述的方法进行，同时以qiagen试剂盒中未使用的硅柱设为对照，将pcr产物同时纯化。再生硅柱采用本发明提供的硅柱再生液完成。将硅柱五次连续清洗和纯化的dna(各取5微升)一起进行琼脂糖凝胶电泳和成像分析。

tbox5基因pcr扩增后，连续使用同一再生硅柱进行纯化并对纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。如图5所示，与新硅柱相比，5次纯化的dna量没有显著差异。说明再生硅柱能反复使用至少5次以上。

实施步骤六、再生硅柱纯化的dna产物可用于基因克隆

将t-box5基因进行pcr扩增，将pcr产物和克隆载体prsetb利用限制性酶bamhi和ecori进行酶切。按照实施步骤四描述的方法，将dna从琼脂糖胶中回收、纯化。利用连接酶将纯化的dna包括载体和目的片段进行连接反应。连接反应在16℃下进行。连接体系如下：

1微升载体prsetb(50ng)；4微升目的片段t-box(80ng)；2微升10x连接缓冲液；1微升连接酶；12微升去离子水；共20微升反应体系。

连接反应进行12小时后，取2微升连接产物与45微升感受态细胞冰上孵育45分钟，孵育结束将样品置于90℃水浴锅中热激1分钟，将样品再次冰浴2分钟，然后将样品均匀涂在lb培养皿上，随后在37℃恒温箱中培养过夜。第二天挑取菌落接种于3毫升lb培养液中培养过夜。第三天收集细菌用axygen质粒提取试剂盒提取质粒并进行酶切鉴定和琼脂糖凝胶电泳、成像分析。结果显示，利用再生硅柱纯化的dna与利用其他硅柱纯化的dna，其克隆的结果没有差异(图6)。说明再生硅柱制备的dna是可以用于基因克隆的。