一种可溶性表达量提高的短小芽胞杆菌CotA漆酶突变体的制作方法

本发明涉及一种可溶性表达量提高的短小芽胞杆菌cota漆酶突变体，属于生物工程技术领域。

背景技术：

漆酶(laccase，e.c.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化还原反应，在木质素及其前体类似物的生物降解中发挥重要作用。漆酶的氧化底物极为广泛，包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，因此漆酶应用潜力巨大。在木材加工领域，漆酶能代替化学胶合剂，不但能提高产品质量，而且能减轻对人体健康的伤害及对环境的污染；在造纸工业中，漆酶用于纸张生物漂白和制浆，可减少制浆造纸厂的污染，有助于造纸业最终实现清洁生产；在食品加工领域，漆酶可用于除去果汁中酚类化合物引起的混浊，从而提高果汁的质量。此外，漆酶还可氧化氯酚及其衍生物，降低其毒性，减少以氯酚类为工业原料生产染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂等化工产品而造成的环境污染。

漆酶按来源不同可分为四大类：植物漆酶、昆虫漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。植物漆酶主要由漆树漆液分离而得。真菌漆酶来源更为广泛(存在于多种担子菌中)，具单电子氧化还原电位高、催化活性强等优点，既能催化底物的氧化聚合又能对木质素进行催化降解，是一直以来人们重点研究的漆酶种类。细菌漆酶则发现相对较晚，最初是1993年由givaμdan等人首先在一种生脂固氮螺菌中鉴定出来的。随后，科研人员又陆续在交替单胞菌、大肠杆菌、假单胞菌、粘质沙雷氏菌、球形芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、极端耐碱芽胞杆菌、灰色链霉菌等细菌中发现了不同种类的具漆酶活性的功能蛋白，如枯草/地衣/短小芽胞杆菌的cota蛋白、海单胞菌的ppoa蛋白、大肠杆菌的cμeo蛋白、灰色链霉菌的epoa蛋白等，这些细菌漆酶与真菌漆酶蛋白结构相似，都具有4个铜离子结合位点。在这些漆酶中，cota漆酶最受研究者关注，其中枯草芽胞杆菌cota漆酶的研究最多，最深入。

由于真菌来源漆酶在工作环境ph偏碱性时活性非常低或几乎没有，热稳定性也较差，且丝状真菌生长周期长，培养基要求高，菌丝在发酵罐中易受到高剪切力的损伤，这大大限制了真菌漆酶在工业上的应用。研究揭示，细菌来源漆酶虽氧化活性普遍略低于真菌来源漆酶，然而它们往往具有一些自身独特的优点：如无需糖基化修饰、热稳定性好、酶活性的最适ph范围广等，这些性质正是目前漆酶工业应用所急需的。然而细菌漆酶本身的表达量较真菌漆酶要低，且在大肠杆菌中易形成包涵体，包涵体的复性比较困难，耗费物力财力。近些年，定点突变技术被运用到提高蛋白的可溶性表达上，并取得良好效果，漆酶可溶性表达量的增加，将有利于其在工业上的应用。

我国每年印染废水排放量占总工业废水排放量的35％，己成为危害最大的重要污染源，大部分合成染料都难以被微生物降解。这些染料化合物通常被用于纺织、食品、塑胶和生物医学的着色剂，每年全世界商用染料使用达7×10⁵吨，种类达1×10⁴种，其中5～10％的染料都以工业污水形式排放出来。有色污水直接释放到环境中，许多染料在厌氧环境下可能转化为有毒物质或致癌物质，众多国家相继都颁布了严厉的法规来限制工业染料污水的排放。由于染料自身特殊的化学结构，使用物理或化学法(凝结、臭氧、活性炭)处理往往效果不佳，且还易造成二次污染。研究表明，生物法(使用漆酶、锰过氧化物酶等)具有脱色率高、运行成本低、绿色环保的优势，是处理印染废水的潜在有效手段，是当前印染废水脱色研究的热点。绝大多数排放的工业印染污水往往温度很高且ph值偏碱。在各类来源的漆酶中，真菌漆酶由于只在ph偏酸环境下具有较好的脱色效果，在偏碱性条件下难以发挥作用，且耐热温度低于细菌漆酶，所以细菌漆酶凭借其独特优势在工业印染废水处理中更具应用潜力。

因此，挖掘能耐受高温和高ph值(耐碱)条件的细菌漆酶基因并实现规模化生产具有重要研究意义和应用价值。本实验室研究并报道了一种活性提高的短小芽胞杆菌cota漆酶突变体(wlf)，在此基础上进行改造获得一株性能稳定，可溶性表达量提高的重组突变体d501g/wlf。

技术实现要素：

本发明要解决的问题是提供一种性能优良，可溶性表达量提高的漆酶突变体d501g/wlf。该突变体以本实验室前期构建的催化活性大大提高的突变体wlf为模板，进一步将wlf的第501位极性带负电荷的天冬氨酸(asp，d)突变为极性不带电荷的甘氨酸(gly，g)，以野生型b.pumilusw3cota(wt)和wlfcota作对照，发现其可溶性表达量增加，并且酶学性质稳定。

所述b.pumilusw3cota漆酶的原始亲本氨基酸序列与ncbi数据库中的b.pumilusw3cota漆酶氨基酸序列一致(本实验室提交，genbank登录号：kf040050)。

所述短小芽孢杆菌漆酶突变体d501g/wlf第501位天冬氨酸突变为甘氨酸，核苷酸序列如seqidno.1，其氨基酸序列如seqidno.2。

本发明还提供一种获得所述漆酶突变体的方法，其特征在于，首先通过序列比对确定501位突变位点，然后以pcoldⅱ-cota(wlf)质粒为模板，设计引物，通过pcr进行定点突变，得到含有突变后的重组质粒pcoldⅱ-cota(d501g/wlf)，转dmt感受态(购于transgen公司)，菌落pcr验证，保存甘油管并测序。将测序结果正确的菌活化、提取质粒转e.colibl21(de3)感受态，并进行菌落pcr验证，将基因大小正确的菌株-80℃保藏甘油管。

本发明还提供一种生产上述d501g/wlf可溶性漆酶的方法，将构建好的保藏在甘油管中的目的菌株接3mllb试管活化，37℃200rpm过夜培养，取1ml活化的菌液接种到含有50ml培养基的摇瓶，培养2-3个小时(od≈0.5)，摇床调至15℃静止培养30min，接着加入终浓度为0.4mm的iptg和0.25mm的cuso4在15℃200rpm的摇床中诱导表达24h。收集发酵液，4℃8000rpm离心10min，弃上清，用ph7.0磷酸缓冲液重悬，超声破碎，可得漆酶上清液。由于重组表达的cota漆酶蛋白带有组氨酸标签(his6·tag)，因此使用镍离子亲和层析法分离目标蛋白。利用aktaavant25蛋白纯化系统经过平衡、上样、洗脱等步骤，最终可得到纯化的cota漆酶。

附图说明

图1为细菌漆酶和真菌漆酶c-末端序列比对图。

图2为定点突变原理示意图。

图3为b.pumilusw3cota漆酶的大肠杆菌重组表达、纯化的sds-page图谱；其中m：蛋白质分子量标准(kda)；1：wlf上清；2：d501g/wlf上清；3：wt纯化；4：wlf纯化；5：d501g/wlf纯化。

图4为b.pumilusw3cota重组漆酶和漆酶突变体的最适反应ph(a)和ph稳定性(b)分析。

图5为b.pumilusw3cota重组漆酶和漆酶突变体的最适反应温度(a)和温度稳定性(b、c、d)分析。

图6为b.pumilusw3cota重组漆酶和漆酶突变体高盐浓度下稳定性分析。

图7为b.pumilusw3cota重组漆酶和漆酶突变体以乙酰丁香酮为介体在碱性条件下对1种偶氮、1种蒽醌、2种三苯甲烷和一种芳香族杂环染料的脱色作用。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

材料和试剂：abts、氨苄青霉素等购于sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；质粒提取试剂盒、定点突变试剂盒购于北京全式金公司；其他试剂均为国内或者国外购买的分析纯试剂；大肠杆菌bl21(de3)菌株购于中国takara宝生物公司等。

实施例1b.pumilusw3漆酶突变体的构建

定点突变原理：点突变原理采用引物引入突变位点，pcrsμpermix合成突变链(图2)。以前期构建成功的重组漆酶突变体wlf的cota漆酶基因序列为模板，设计引物，将漆酶中第501位天冬氨酸(asp，d)突变为甘氨酸(gly，d)。设计的相关正向引物和反向引物如下：

前引f5’-aacacgaggattatggcatgatgcggcc-3’

后引r5’-ccataatcctcgtgttctaatatgtgac-3’

其中下划线部分分别代表突变体基因编码的501位甘氨酸所对应的密码子。pcr扩增体系为：质粒dna3μl，前引(10μm)1μl，后引(10μm)1μl，pcrsμpermix25μl，ddh2o补至50μl，pcr扩增条件为94℃变性4min，循环25次(94℃20s，55℃20s，72℃3min)，最后72℃延伸10min。取5μlpcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并检测到目的条带正确。将1μldmt酶加入剩余的pcr产物中，混匀，37℃孵育1小时，加入3μldmt酶消化产物于100μl感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟。42℃水浴热击45s，立即置于冰上2min；然后加900μl平衡至室温的lb培养基，37℃200rpm培养1h，最后将转化产物涂布于含100mgl^-1氨苄青霉素的lb平板，经37℃过夜培养，从平板上挑选10个单菌落进行菌落pcr验证，从验证成功的菌落中挑5个单菌落接种到lb液体培养基，10h后将每个单菌落保存2个甘油管，一份-80℃保藏，一份用于测序。将测序正确的突变体从甘油管接种到lb液体培养基中过夜活化，之后先保存甘油管，然后剩余菌液提取质粒，并转化bl21(de3)感受态细胞。

实施例2b.pumilusw3漆酶的表达与纯化

表达：从甘油管中接种野生型重组漆酶表达菌株和前期构建的wlf和d501g/wlf重组表达菌株到lb培养基中活化，37℃，200rpm过夜(10h)。按2％接种量分别将种子接入50mllb液体发酵培养基(含100mgl^-1氨苄青霉素)37℃200rpm摇床培养至od600达到0.5，然后摇床温度调至15℃静止培养30min，接着加入终浓度0.4mmiptg和0.25mmcuso4进行诱导，15℃200rpm培养24h，将发酵液于4℃8000rpm离心10min去除上清，收集菌体。将收集的菌体用磷酸盐缓冲液重悬，重悬后用超声波细胞破碎仪将菌体破碎释放胞内蛋白，破碎完成后，将破碎的液体离心20min(4℃、8000rpm)，然后将上清在70℃水浴加热15min，10000rpm4℃离心10min去沉淀，收集上清。收集的上清用于cota漆酶蛋白纯化。

纯化：由于重组表达的cota漆酶带有多聚组氨酸标签(his6·tag)，因此使用镍离子亲和层析法分离目标蛋白。镍离子亲和层析纯化蛋白的步骤：(1)平衡：用10倍住体积的20mm缓冲液(含5mm的咪唑)平衡histraphp镍离子柱(1ml)；(2)上样：预先处理好的样品以1mlmin^-1的流速上样；(3)洗脱：用高浓度咪唑进行梯度洗脱，收集洗脱条件下峰型对应的管号，并做酶活检测，收集单峰对应的有酶活的蛋白，跑sds-page蛋白电泳确认单一条带，获得纯化的酶。

实施例3b.pumilusw3漆酶的酶活测定和表达量分析

(1)酶活单位定义：采用abts方法测定漆酶酶活时，定义每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量为一个活力单位。

(2)酶活测定步骤：1预热：取2.4mlph4.0的柠檬酸缓冲液于试管中，在试管中加入0.5mlabts溶液(abts终浓度为0.5mm)置于50℃水浴锅中预热5min；2反应：加入稀释好的0.1ml样品酶液，震荡均匀。3测量：用分光光度计对震荡均匀的样品进行动力学测量，在420nm波长下测量30s内每分钟od值的变化量(测量反应显示直线)并计算酶活力。

(3)动力学参数测定：以不同浓度的abts作为底物来测定纯酶的动力学参数。反应体系为3ml，abts的终浓度为10-1000μm。3ml的反应体系包括2.4ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(100mm、ph3.6)、0.1ml纯酶液、0.5mlabts溶液(分别配成终浓度10μm、20μm、40μm、60μm、80μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、1000μm)。将反应体系置于50℃水浴锅中预热，然后加酶在420nm波长下测定30s内od值的变化量(反应速率为匀速反应)。根据酶活力公式计算酶活。

酶活力公式：

式中：△od-反应时间内吸光度值的差v总-反应体系的体积(l)

n-酶液稀释倍数△t-反应时间(min)

vo-酶液的体积(l)m酶-酶蛋白的质量(mg)

ε–底物摩尔消光系数，ε420＝3.6×10⁴l·mol^-1·cm^-1

以abts为底物测定了野生型、突变体wlf和突变体d501g/wlf漆酶的动力学参数vmax、km、kcat、kcat/km、比活力，总活力以及蛋白含量。结果如下：

表1野生型(wt)和突变体漆酶的动力学参数和表达量

注：总活力(volμmetricactivity)浓缩了5倍。

从表1可以看出，突变体d501g/wlf的催化效率比wt要高，略低于wlf，但可溶性表达量d501g/wlf有明显提高。

实施例4纯化的b.pumilusw3重组漆酶和漆酶突变体最适作用ph和ph稳定性分析

采用常规测定方法(均有文献可参考)，使用abts作为底物，反应温度均为50℃。1个酶活单位定义为1分钟内氧化1μm底物所需的酶量。实验结果充分表明重组漆酶和漆酶突变体都具有长时间耐碱性环境佳的优点，虽然突变体d501g/wlfph稳定性较wt和wlf差一些，但依然很稳定，相比较其他类型的酶属于稳定性很强的酶(如图4所示)。

实施例5纯化的b.pumilusw3重组漆酶和漆酶突变体最适作用温度和温度稳定性分析

采用常规测定方法，使用abts作为底物，反应ph3.6。1个酶活单位定义为1分钟内氧化1μm底物abts所需的酶量。实验结果充分表明重组漆酶和漆酶突变体具有长时间耐高温环境佳的优点(如图5所示)。

实施例6纯化的b.pumilusw3重组漆酶和漆酶突变体耐盐性分析

首先将wt、wlf、d501g/wlf漆酶分别都保存于三种不同浓度的nacl溶液中(100mm、500mm、1m)，保存于4℃冰箱10h，然后在ph3.6、50℃条件下以abts为底物测酶活，反应体系3ml，方法同实施例3中的酶活测定方法。实验结果如图6所示，结果表明重组漆酶和漆酶突变体在高盐浓度下具有良好的稳定性。

实施例7b.pumilusw3重组漆酶和漆酶突变体在碱性条件下对偶氮类、蒽醌类、三苯甲烷类和芳香族杂环类染料的脱色率测定

采用常规测定方法：反应体系为5ml，染料0.25mg，纯化后的漆酶10μg，介体为乙酰丁香酮，介体浓度1mm，反应温度为37℃，ph10，缓冲液为碳酸缓冲液。实验结果显示在碱性环境ph10，作用10h后，三种重组漆酶对1种偶氮类染料acidred1的脱色率分别达到86.5％、93.3％和92.1％，对1种蒽醌类染料acidblμe129的脱色率分别达到80.9％、85.4％和95.6％，同样对三苯甲烷类和芳香族杂环类染料也具有良好脱色效果，对芳香族杂环类染料的脱色率要低于其他几种类型染料(如图7所示)。以上数据表明该重组漆酶在碱性环境下对偶氮类染料和蒽醌类染料以及三苯甲烷类染料均具有很好的脱色效果，具有较大应用潜力。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种可溶性表达量提高的短小芽胞杆菌cota漆酶突变体

<160>2

<210>seqidno.1

<211>1533bp

<212>dna

<213>根据基因序列设计，用于基因表达。

<400>seqidno.1

1atgaacctagaaaaatttgttgacgagctgccaattccagaagtcgcagagcccgtcaaa

61aaaaacccaagacaaacgtattatgaaatcgctatggaggaggtgttcctaaaagttcat

121agtgatctgcccccaaccaagttatggacctataatggcggtttgccttttccaaccatt

181aaagcgaatcgaaatgaaaaggtcaaagtgaaatggatgaacaaattgccgctgaaacac

241ttcctgcctgtcgatcataccattcacgctggacaccatgatgaacccgaagtcaaaaca

301gtcgttcacctgcatgggggcgtgacacctgcaagcagtgacggttatccagaggcttgg

361ttttcgcgagactttgaagcgaccggccccttctttgaacgagaggtttacgaataccct

421aatcaccagcaagcatgcacattgtggtatcacgatcatgccatggcattaacacgatta

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721ccatatttagaagtagagcctcgaaaatatcgttttcgtatcttaaacgcgtccaataca

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841ggctttttgccaagacctgttcatcaccaatcttttagcattgcacctgctgaacgtttt

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961ggctgcggtcaggaagtcaatccagaaacagatgcgaacattatgcaatttaaagtcact

1021cgaccgctcaaaggaagagcagctaaaacattacgtccgatcttcaaaccacttccacca

1081ctccggccgagccgagctgataacgagcgaacgctgacccttactggcacacaagataaa

1141tatgggcgccctatttggttactagataaccagttttggaatgatcctgttacggaaaat

1201cctcgacttggcagtgtagaggtatggaacatcgttaacccaacaaggctcacacaccct

1261attcatttacatcttgttcaatttcgggtgattgatagaagaccattcgatacagacatc

1321tatcaatcaacaggtgaaatcgtgtacacgggaccaaatgaagcgcctcctttgcatgaa

1381caaggatacaaggatacaattcaggcgcatgccggtgaagtcattcgcatcatcgctcgg

1441tttgtcccatatagcggacggtatgtgtggcattgtcacatattagaacacgaggattat

1501ggcatgatgcggccgatggatatcatccagtaa

<210>seqidno.2

<211>510

<212>prt

<213>短小芽胞杆菌w3突变体d501g/wlf(b.pumilusw3d501g/wlf)

1mnlekfvdelpipevaepvk

21knprqtyyeiameevflkvh

41sdlpptklwtyngglpfpti

61kanrnekvkvkwmnklplkh

81flpvdhtihaghhdepevkt

101vvhlhggvtpassdgypeaw

121fsrdfeatgpfferevyeyp

141nhqqactlwyhdhamaltrl

161nvyaglagfylisdafeksl

181elpkdeydiplmimdrtfqe

201dgalfypsrpnntpedsdlp

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