一种沉积物中腐殖质的提取、纯化和分级方法与流程

本发明涉及沉积物中腐殖质的提取、纯化及分级，属于腐殖物质提取领域。

背景技术：

腐殖物质(humicsubstance，hs)是自然环境中广泛存在的一类高分子、含有多种官能团的聚电解质，广泛存在于土壤、河流、湖泊以及海洋中，地球表面的腐殖物质的总量已达1.5×10⁶kg，在水环境中，河水中腐殖质的平均含量为10-50mg/l，底泥腐殖质含量更为丰富，约占底泥1％-3％。

在水环境中，腐殖物质与金属离子、矿物胶和非腐殖化有机物相互作用形成一个复杂的体系，只有从水和沉积物中分离出游离态的腐殖质，才能对其结构、化学性质和功能进行详细的研究。

沉积物中腐殖质的定量提取、分离与纯化是对腐殖质进行研究的前提，而目前，据报道提取土壤及沉积物中腐殖质的方法有很多，包括有机溶剂提取、无机溶剂提取和有机/无机溶剂混合提取法。传统焦磷酸钠法最大问题在于，仅利用硫酸分离腐殖酸和富里酸，另外分离过程需在温度为80的条件下进行，该方法提取出来的腐殖质纯度不够，腐殖酸和富里酸分离不完全，丙酮、dmso、pyridine、二氧杂环己烷等有机溶剂提取的腐殖质提取产率低，提取的多为分子量小的有机质，且部分有机提取剂最终很难与有机质分离(hayes、eloff等)，由于缺少标准方法，在以往的研究中，沉积物腐殖质的提取方法各有不同，提取剂，提取液剂量，提取次数，纯化方法的选择各有特点，使得研究的数据可比性较低。

腐殖质作为自行组装的超分子聚合体，其中相对分子量小的分子通过氢键和疏水键与聚合体相结合。分子量大小不同的组成对环境中的生物化学作用各自不同，特别是小分子量的腐殖质可以通过土壤空隙与化合物接触，进而发生各种反应。因此，通过分子量不同将纯化后的腐殖酸和富里酸进行分级，得到不同的亚组分对进一步研究腐殖质的性质特征尤为必要。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种沉积物中腐殖质的提取、纯化和分级方法，以解决现有腐殖质提取缺少标准方法，各种方法间研究的数据可比性较低，而国际腐殖质推荐的方法无法将沉积物中活性有机质(在植物根系和微生物作用下可以释放的有机质)完全提取出来的问题，进而对提取纯化后的腐殖质进行分级以更好的研究腐殖质的化学特性。

为解决上述问题，拟采用这样一种沉积物中腐殖质的提取、纯化和分级方法，包括：

首先将底泥离心，冷冻干燥，对底泥进行前处理，去除树根和石子，向土壤样品中加入超纯水，使固液比为1：5，用酸(1mhcl)调ph值到1，然后向固液混合物中加入0.1mhcl，使固液比为1：10，连续搅拌6h，静置24h后离心，保存上清液i(富里酸1)和酸洗沉积物样品；

向酸洗沉积物样品中加入超纯水，使其固液比为1:5，向固液混合物中通入氮气15min以排除溶解氧，腐殖酸在中性和碱性条件下易被溶解氧氧化改变其本身性质，向混合物中持续通入氮气，在氮气保护下，加入1mnaoh，使其ph为7，然后在氮气保护下，冷却至20℃，加入焦磷酸钠溶液，并用超纯水稀释，使焦磷酸钠浓度为0.2m且固液比为1:10，将加入焦磷酸钠的土壤固液混合物隔绝空气持续搅拌8h，在此期间通氮气3次，每次15min，以排除溶解氧的影响，然后静置24h后，离心得上清液ii和残渣，丢弃残渣；

在氮气保护下，向上清液ii加1mhcl使溶液ph值为1，磁力搅拌30min后，静置28h，使富里酸和腐殖酸充分分离，随后离心分离，即得上清液为富里酸2，沉淀为腐殖酸；

纯化腐殖酸：

在氮气保护下，向腐殖酸沉淀中加入0.1mnaoh使其完全溶解后立即停止加入naoh，记录所消耗naoh的体积，而后加入nacl固体，使溶液中na⁺为0.3m，高速(10000rpm)离心，快速将上清液iii和沉淀分离，丢弃沉淀，向上清液iii中迅速加入6mhcl，使其酸化至ph＝1，搅拌30min，静置24h，离心后去除上清液，沉淀即为无杂酸的腐殖酸；

向沉淀中加入0.1mhcl/0.3mhf溶液中，使固液比为1:10，振荡过夜，离心分离，得沉淀。重复此步骤2‐3次，即得无硅腐殖酸；

向无硅腐殖质中加入超纯水，使之为泥状后转至透析袋中，透析48‐72h，期间换2‐3次透析溶液，对透析袋外的溶液进行钼氨酸分光光度法和硝酸银检测透析袋外溶液中磷含量和氯离子含量,如果磷含量>0.01mg/l或者有氯化银沉淀出现，则继续更换透析袋外超纯水，搅拌24h后，再次测定，直至磷含量<0.01mg/l且检测不出氯离子；

将透析袋中泥状腐殖酸转至烧杯后，置于真空干燥箱，40度干燥6h后得到固体粉末即为纯化后的腐殖酸；

腐殖酸的分级：

将纯化后的富里酸固体用少量的ph7的naoh溶液溶解完全后转至截留分子量为3500的透析袋中，用透析袋夹夹紧以防溶液从透析袋中泄露，将装有腐殖酸溶液的透析袋放置于装有500ml超纯水的ph7的naoh溶液中，磁力搅拌72h，转速为400rpm，烧杯外贴一层铝箔纸以防光化学反应的发生，每隔24h更换naoh溶液并将其收集，放置于冰箱，72h后将收集三次的naoh溶液混合，冷冻干燥，得到腐殖酸亚组分1。

将截留分子量为3500透析袋中的腐殖酸溶液转至截留分子量为15000透析袋中，按处理腐殖酸亚组分1的步骤来进行分级，得到腐殖酸亚组分2。

将透析72h后的截留分子量为14000透析袋中剩余腐殖酸溶液收集，冷冻干燥，得到腐殖酸亚组分3。

纯化富里酸：

将上清液i以每小时15倍床的速度通过xad‐8大孔吸附树脂，每1g沉积物样品对0.15ml树脂，丢弃出水，用0.65倍柱体积的超纯水冲洗吸附富里酸的xad‐8柱子，然后用1倍体积的0.1mnaoh冲洗柱子，再用2‐3倍柱体积的超纯水冲洗柱子，接液，立即用6mhcl将溶液酸化至ph＝1，加入浓hf溶液，使体系中氢氟酸的最终浓度为0.5m，溶液中务必使富里酸全部溶解，得富里酸a；

将富里酸2通过xad‐8大孔吸附树脂，每克沉积物样品对2.0ml‐3.0ml树脂，冲洗速度为每小时15床，出水是否接液依其颜色而定，若基本无色则无需接液，若出水颜色较深则需接液，待富里酸2溶液全部通过树脂后，用0.65倍柱体积的超纯水冲洗吸附富里酸的xad‐8树脂，然后用1倍体积的0.1mnaoh冲洗柱子，然后用3‐4倍柱体积的超纯水冲洗柱子，接液，立即用6mhcl将溶液酸化至ph＝1，加入浓hf溶液，使体系中氢氟酸的最终浓度为0.5m，溶液中富里酸全部溶解，得富里酸b；

富里酸2的出水再次通过xad‐8吸附树脂，每1g沉积物样品对1.0‐2.0ml树脂，按处理富里酸1的步骤来进行洗涤和酸化，得富里酸c，将富里酸a,b和c洗涤液收集起来，混合，将其通过xad‐8吸附树脂，吸附柱体积为样品体积的1/5，用体积为0.65倍柱体积的蒸馏水漂洗树脂，等于柱体积的0.1mnaoh溶液洗涤吸附树脂，再用2倍柱体积的蒸馏水漂洗，将洗涤液通过2‐3倍溶液中na+摩尔量的饱和的732强酸苯乙烯阳离子交换树脂，接液，冷冻干燥提取物即可得到纯化后的富里酸。

富里酸的分级：

将纯化后的富里酸固体用少量的超纯水溶解完全后转至截留分子量为3500的透析袋中，用透析袋夹夹紧以防溶液从透析袋中泄露。将装有富里酸溶液的透析袋放置于装有500ml超纯水的烧杯中，磁力搅拌72h，转速为400rpm，烧杯外贴一层铝箔纸以防光化学反应的发生。每隔24h更换超纯水并将其收集，放置于冰箱。72h后将收集三次的超纯水混合，冷冻干燥，得到富里酸亚组分1。

将截留分子量为3500透析袋中的富里酸溶液转至截留分子量为14000透析袋中，按处理富里酸亚组分1的步骤来进行分级，得到富里酸亚组分2。

将透析72h后的截留分子量为14000透析袋中剩余富里酸溶液收集，冷冻干燥，得到富里酸亚组分3。

与现有技术及国际腐殖质推荐的方法相比较，本发明所述方法能够将土壤及沉积物中活性有机质更为完全提取出来，从而可以更全面、完整地表征土壤活性机质的特性，同时，将传统焦磷酸钠法进行改进，对提取物通过联合树脂进行纯化，以获得全面的、高纯度腐殖酸及富里酸，通过透析对不同分子量的腐殖酸和富里酸进行分级，获得纯化后腐殖酸和富里酸的亚组分，可更好地研究不同分子量的腐殖酸和富里酸的氧化还原、光化学活性等性质特征。

附图说明

图1是富里酸的红外图谱；

图2是富里酸的三维荧光光谱；

图3是腐殖酸的红外图谱；

图4是腐殖酸的三维荧光光谱。

具体实施方式

实施例1：

参照附图1至4。

采集贵阳市百花湖中底泥，将底泥离心，冷冻干燥后得到底泥粉末，去除树根和石子。称取干燥后的底泥样品50g。向土壤样品中加入250ml超纯水，使固液比为1：5，用78ml1mhcl将混合物调ph值到1，然后向固液混合物中加入172ml0.1mhcl，使固液比为1：10，连续搅拌6h，静置24h后离心，保存上清液i(富里酸1)和酸洗沉积物样品；得富里酸1为450ml。

向酸洗沉积物样品中加入246ml超纯水，使其固液比为1:5，向固液混合物中通入氮气15min以排除溶解氧，在氮气保护下，加入4ml1mnaoh，使其ph为7，然后在氮气保护下，，加入250ml0.2m冷却至20℃的焦磷酸钠溶液，使固液混合物中焦磷酸钠浓度为0.1m且固液比为1:10，将加入焦磷酸钠的土壤固液混合物隔绝空气持续搅拌8h，在此期间通氮气3次，每次15min，以排除溶解氧的影响，然后静置24h后，离心得495ml上清液ii和残渣，丢弃残渣；

在氮气保护下，向上清液ii加152ml1mhcl使溶液ph值为1，磁力搅拌30min后，静置28h，使富里酸和腐殖酸充分分离，随后离心分离，即得647ml富里酸2，沉淀为腐殖酸；

沉积物中腐殖质的纯化：

步骤一：在氮气保护下，向腐殖酸沉淀中加入11.7ml0.1mnaoh使其完全溶解后立即停止加入naoh，而后加入0.136gnacl固体高速(10000rpm)离心，快速将上清液iii和沉淀分离，丢弃沉淀，向上清液iii中迅速加入1.3ml6mhcl，使其酸化至ph＝1，搅拌30min，静置24h，离心后去除上清液，沉淀即为无杂酸的腐殖酸；

向沉淀中加入少许0.1mhcl/0.3mhf溶液将固液混合物转至塑料瓶中，反复此步骤3‐5次，将沉淀完全转至塑料瓶中，将剩余hcl/hf全部转入塑料瓶中，使固液比为1:10(共100ml0.1mhcl/0.3mhf溶液)，振荡过夜，离心分离(5min，10000rpm)，得沉淀。重复此步骤3次，即得无硅腐殖酸；

向无硅腐殖酸中加入少量超纯水，使之为泥状后转至md44(3500)透析袋中，透析72h，期间换3次透析溶液，对透析袋外的溶液进行钼氨酸分光光度法和硝酸银检测透析袋外溶液中磷含量和氯离子含量,已检测不出氯离子，磷含量为0.003mg/l，达到要求；

将透析袋中泥状腐殖酸转至烧杯后，置于真空干燥箱，40度干燥6h后得到固体粉末即为纯化后的腐殖酸；

将纯化后的腐殖酸固体用少量的ph7的naoh溶液溶解完全后转至visakasemd34(3500)透析袋中，用透析袋夹夹紧以防溶液从透析袋中泄露。将装有腐殖酸溶液的透析袋放置于装有500ml超纯水的ph7的naoh溶液中，磁力搅拌72h，转速为400rpm，烧杯外贴一层铝箔纸以防光化学反应的发生。每隔24h更换naoh溶液并将其收集，放置于冰箱。72h后将收集三次的naoh溶液混合，冷冻干燥，得到腐殖酸亚组分1。

将visakasemd34(3500)透析袋中的腐殖酸溶液转至visakasemd34(8000‐14000)透析袋中，按处理腐殖酸亚组分1的步骤来进行分级，得到腐殖酸亚组分2。

将透析72h后的visakasemd34(8000‐14000)透析袋中剩余腐殖酸溶液收集，冷冻干燥，得到腐殖酸亚组分3。

步骤二：将450ml上清液i以112.5ml/h速度通过体积为7.5mlxad‐8大孔吸附树脂丢弃出水，用4.86ml超纯水冲洗吸附富里酸的xad‐8柱子，然后用7.5ml0.1mnaoh冲洗柱子，再用22.5ml的超纯水冲洗柱子，接液，立即用0.53ml6mhcl将溶液酸化至ph＝1，加入1.05ml浓hf溶液，使体系中氢氟酸的最终浓度为0.5m，溶液中务必使富里酸全部溶解，得31.58ml富里酸a；

将富里酸2通过150mlxad‐8大孔吸附树脂，冲洗速度为2.25l/h，由于出水颜色较深，则需出水接液，待富里酸2溶液全部通过树脂后，用97.5ml的超纯水冲洗吸附富里酸的xad‐8树脂，然后用150ml0.1mnaoh冲洗柱子，然后用600ml超纯水冲洗柱子，接液，立即用1.9ml6mhcl将溶液酸化至ph＝1，加入12.64ml浓hf溶液，使体系中氢氟酸的最终浓度为0.5m，溶液中务必使富里酸全部溶解，得864ml富里酸b；

体积为864ml富里酸2的出水再次通过xad‐8吸附树脂，过100ml树脂，按处理富里酸1的步骤来进行洗涤和酸化，得477.8ml富里酸c，将富里酸a，b和c洗涤液收集起来，混合，将其通过270mlxad‐8吸附树脂，用体积为175.5ml蒸馏水漂洗树脂，270ml0.1mnaoh溶液洗涤吸附树脂，再用540ml的蒸馏水漂洗，将洗涤液通过2‐3倍溶液中na⁺摩尔量的饱和的732强酸苯乙烯阳离子交换树脂，接液，冷冻干燥提取物即可得到纯化后的富里酸。

富里酸的分级：

将纯化后的富里酸固体用少量的超纯水溶解完全后转至截留分子量为visakasemd34(3500)透析袋中，用透析袋夹夹紧以防溶液从透析袋中泄露。将装有富里酸溶液的透析袋放置于装有500ml超纯水的烧杯中，磁力搅拌72h，转速为400rpm，烧杯外贴一层铝箔纸以防光化学反应的发生。每隔24h更换超纯水并将其收集，放置于冰箱。72h后将收集三次的超纯水混合，冷冻干燥，得到富里酸亚组分1。

将visakasemd34(3500)透析袋中的富里酸溶液转至visakasemd34(8000‐14000)透析袋中，按处理富里酸亚组分1的步骤来进行分级，得到富里酸亚组分2。

将透析72h后的visakasemd34(8000‐14000)透析袋中剩余富里酸溶液收集，冷冻干燥，得到富里酸亚组分3。

实施例2：

采集遵义板山水库底泥，将底泥离心，冷冻干燥后得到底泥粉末，去除树根和石子。称取干燥后的底泥样品50g。向土壤样品中加入250ml超纯水，使固液比为1：5，用9ml1mhcl将混合物调ph值到1，然后向固液混合物中加入241ml0.1mhcl，使固液比为1：10，连续搅拌6h，静置24h后离心，保存上清液i(富里酸1)和酸洗沉积物样品；得富里酸1为380ml。

向酸洗沉积物样品中加入245ml超纯水，使其固液比为1:5，向固液混合物中通入氮气15min以排除溶解氧，在氮气保护下，加入5ml1mnaoh，使其ph为7，然后在氮气保护下，加入250ml0.2m冷却至20℃的焦磷酸钠溶液，使固液混合物中焦磷酸钠浓度为0.1m且固液比为1:10，将加入焦磷酸钠的土壤固液混合物隔绝空气持续搅拌8h，在此期间通氮气3次，每次15min，以排除溶解氧的影响，然后静置24h后，离心得400ml上清液ii和残渣，丢弃残渣；

在氮气保护下，向上清液ii加72ml1mhcl使溶液ph值为1，磁力搅拌30min后，静置28h，使富里酸和腐殖酸充分分离，随后离心分离，即得375ml上清液为富里酸2，沉淀为腐殖酸；

沉积物中腐殖质的纯化：

步骤一：在氮气保护下，向腐殖酸沉淀中加入100ml0.1mnaoh使其完全溶解后立即停止加入naoh，而后加入2.14gnacl固体高速(10000rpm)离心，快速将上清液iii和沉淀分离，丢弃沉淀，向上清液iii中迅速加入3.5ml6mhcl，使其酸化至ph＝1，搅拌30min，静置24h，离心后去除上清液，沉淀即为无杂酸的腐殖酸；

向沉淀中加入少许0.1mhcl/0.3mhf将固液混合物转至塑料瓶中，反复此步骤3‐5次，将沉淀完全转至塑料瓶中，将剩余hcl/hf全部转入塑料瓶中，使固液比为1:10(共250ml)，振荡过夜，离心分离(5min，10000rpm)，得沉淀。重复此步骤3次，即得无硅腐殖酸；

向无硅腐殖酸中加入少量超纯水，使之为泥状后转至md44(3500)透析袋中，透析72h，期间换3次透析溶液，对透析袋外的溶液进行钼氨酸分光光度法和硝酸银检测透析袋外溶液中磷含量和氯离子含量,已检测不出氯离子，磷含量为0.002mg/l，达到要求；

将透析袋中泥状腐殖酸转至烧杯后，置于真空干燥箱，40度干燥6h后得到固体粉末即为纯化后的腐殖酸；

将纯化后的腐殖酸固体用少量的ph7的naoh溶液溶解完全后转至visakasemd34(3500)透析袋中，用透析袋夹夹紧以防溶液从透析袋中泄露。将装有腐殖酸溶液的透析袋放置于装有500ml超纯水的ph7的naoh溶液中，磁力搅拌72h，转速为400rpm，烧杯外贴一层铝箔纸以防光化学反应的发生。每隔24h更换naoh溶液并将其收集，放置于冰箱。72h后将收集三次的naoh溶液混合，冷冻干燥，得到腐殖酸亚组分1。

将visakasemd34(3500)透析袋中的腐殖酸溶液转至visakasemd34(8000‐14000)透析袋中，按处理腐殖酸亚组分1的步骤来进行分级，得到腐殖酸亚组分2。

将透析72h后的visakasemd34(8000‐14000)透析袋中剩余腐殖酸溶液收集，冷冻干燥，得到腐殖酸亚组分3。

步骤二：将380ml上清液i以117ml/h速度通过体积为7.8mlxad‐8大孔吸附树脂丢弃出水，用5.07ml超纯水冲洗吸附富里酸的xad‐8柱子，然后用7.8ml0.1mnaoh冲洗柱子，再用23.4ml的超纯水冲洗柱子，接液，立即用0.6ml6mhcl将溶液酸化至ph＝1，加入0.82ml浓hf溶液，使体系中氢氟酸的最终浓度为0.5m，溶液中务必使富里酸全部溶解，得39.0ml富里酸a；

将富里酸2通过120mlxad‐8大孔吸附树脂，富里酸溶液颜色相对较浅，冲洗速度为2.25l/h，出水接液，待富里酸2溶液全部通过树脂后，用78ml的超纯水冲洗吸附富里酸的xad‐8树脂，然后用120ml0.1mnaoh冲洗柱子，然后用360ml超纯水冲洗柱子，接液，立即用2.0ml6mhcl将溶液酸化至ph＝1，加入12.6ml浓hf溶液，使体系中氢氟酸的最终浓度为0.5m，溶液中务必使富里酸全部溶解，得572ml富里酸b；

将富里酸a,b洗涤液收集混合，将其通过120mlxad‐8吸附树脂用体积为78ml的蒸馏水漂洗树脂，120ml0.1mnaoh溶液洗涤吸附树脂，再用240ml蒸馏水漂洗，收集洗涤液将洗涤液通过2‐3倍溶液中na⁺摩尔量的饱和的732强酸苯乙烯阳离子交换树脂，接液，冷冻干燥提取物即可得到纯化后的富里酸。

富里酸的分级：

将纯化后的富里酸固体用少量的超纯水溶解完全后转至截留分子量为visakasemd34(3500)透析袋中，用透析袋夹夹紧以防溶液从透析袋中泄露。将装有富里酸溶液的透析袋放置于装有500ml超纯水的烧杯中，磁力搅拌72h，转速为400rpm，烧杯外贴一层铝箔纸以防光化学反应的发生。每隔24h更换超纯水并将其收集，放置于冰箱。72h后将收集三次的超纯水混合，冷冻干燥，得到富里酸亚组分1。

将visakasemd34(3500)透析袋中的富里酸溶液转至visakasemd34(8000‐14000)透析袋中，按处理富里酸亚组分1的步骤来进行分级，得到富里酸亚组分2。

将透析72h后的visakasemd34(8000‐14000)透析袋中剩余富里酸溶液收集，冷冻干燥，得到富里酸亚组分3。