一种γδT细胞培养方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种γδt细胞培养方法。
背景技术：
：γδt细胞是一类分布于外周血及粘膜组织的非mhc限制性固有t淋巴细胞，γδt细胞被认为是介于获得性与天然免疫之间的特殊免疫细胞类型，占cd3+t细胞的1％～5％，大部分γδt细胞不表达cd4、cd8分子，有特异性识别抗原功能而无mhc限制，并在机体抗感染和自身免疫疾病及抗肿瘤等过程中起重要作用。在人体的外周血中均能分离得到γδt细胞。在大肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中亦分离得到γδt细胞。γδt细胞不仅能杀伤自体肿瘤细胞，还能杀伤异体肿瘤细胞，但对正常细胞无毒性。现有γδt细胞培养技术是直接分离外周血中的单个核细胞(pbmc)，然后将pbmc细胞在含有一定浓度的il-2的培养基中与肿瘤细胞混合培养2周，得到109的细胞，并将其作为细胞制剂，运用于机体保健或临床。现有技术主要采用il-2和肿瘤细胞共同刺激单个核细胞，使细胞进行扩增。其缺点主要是细胞扩增倍数相对较低，纯度相对较低，且存在肿瘤细胞无法完全与γδt细胞分开等风险。技术实现要素：有鉴于此，本发明公开了一种γδt细胞培养方法，本发明将将高密度细胞培养瓶进行改造，然后将分离得到的单个核细胞采用il-2进行诱导，培养γδt细胞，并且采用肿瘤细胞裂解后的内容物来致敏γδt细胞，使γδt细胞的扩增效果得到增强，且其杀伤活性也大大增强。本发明公开的γδt细胞培养方法包括以下步骤：1)收集外周血，离心分离得到外周血单个核细胞；2)对步骤1)分离得到的外周血单个核细胞进行诱导培养；3)制备肿瘤细胞裂解内容物，将所述肿瘤细胞裂解内容物与步骤2)的产物进行共培养；4)对步骤3)的产物进行检测。优选地，步骤2)所述的诱导培养为：将步骤1)分离得到的细胞以一定密度加入到xvivo-15培养基，并往培养基中加入浓度为50-500μg/ml的okt-3和浓度为100-1000u/ml的il-2。在本发明提供的实施例中，xvivo-15培养基购至瑞士lonza公司。作为优选，诱导培养的条件为37℃，二氧化碳含量为5％的二氧化碳培养箱。作为优选，诱导培养采用高密度细胞培养瓶进行培养。在本发明提供的实施例中，高密度细胞培养瓶购至美国cellline公司。在本发明中，高密度细胞培养瓶为一种双室细胞培养瓶，主要模拟生物反应器进行细胞培养。在本发明中，肿瘤细胞裂解内容物为k562细胞经过反复冻融离心后的上清液。优选地，肿瘤细胞裂解内容物的制备方法为：将肿瘤细胞k562从培养箱中拿出来，迅速放入-196℃的液氮中30分钟。从液氮中拿出来使劲摇晃，直到完成融解。再放入-196℃的液氮中。如此反复3-5次，直到肿瘤细胞完全破裂，细胞内容物完全释放出来。然后将细胞内容物进行离心，5000rpm10分钟，收集上清液即为肿瘤细胞裂解内容物。用bca法检测内容物的蛋白浓度，得蛋白浓度为62.4μg/ml。相比于现有技术，本发明公开的γδt细胞培养方法具有以下优点：1、本发明专利主要采用改造后的高密度细胞培养瓶，在添加il-2的情况下诱导培养γδt细胞，使γδt细胞的扩增效果得到增强，且所用培养基减少，继而降低了生产成本；2、本发明专利采用肿瘤细胞裂解后的内容物刺激γδt细胞，使其杀伤活性大大增强，且规避了γδt细胞终仍混有辐照后的肿瘤细胞的风险。附图说明图1示培养2周后γδt细胞的形态(100倍)，其中1-1为对比例1培养的γδt细胞，1-2为实施例1培养的γδt细胞；图2示培养2周后γδt细胞的流式检测结果；其中2-1～2-7分别为实施例1-6、对比例1培养的γδt细胞流式检测结果。具体实施方式本发明公开了一种γδt细胞培养方法。下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。实施例中使用的试剂和组分均为市售或自制来源。在本发明中，高密度细胞培养瓶为一种双室细胞培养瓶，主要模拟生物反应器进行细胞培养。该高密度细胞培养瓶购至cellline公司。肿瘤细胞裂解内容物为k562细胞经过反复冻融离心后的上清液。k562细胞为人慢性髓系白血病细胞株，由暨南大学生物医药研究基地惠赠。实施例1：(1)采集志愿者20ml血液；(2)离心后收集血浆；(3)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有ficoll分离液(购至stemcell公司)的sepmate离心管(购至stemcell公司)中，离心10-20min；(4)离心后将上层液体从离心管中倒出，再加入一定量的生理盐水重悬细胞，离心；(5)按照1-2×106的细胞密度加入xvivo-15培养基进行培养，并在培养基中加入50μg/ml的okt-3和100u/ml的il-2。每日观察γδt细胞的形态(图1-2)。(6)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml肿瘤细胞裂解后的内容物，对γδt细胞进行刺激。(8)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(9)14天后，抽取1×106的细胞进行γδt细胞进行流式检测，抽取8×106的细胞对k562细胞进行杀伤活性检测，抽取部分消培养液检测il-4和ifn-γ的表达量。实施例2：(1)采集志愿者20ml血液；(2)离心后收集血浆；(3)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有ficoll分离液(购至stemcell公司)的sepmate离心管(购至stemcell公司)中，离心10-20min；(4)离心后将上层液体从离心管中倒出，再加入一定量的生理盐水重悬细胞，离心；(5)按照1-2×106的细胞密度加入xvivo-15培养基进行培养，并在培养基中加入500μg/ml的okt-3和100u/ml的il-2。每日观察γδt细胞的形态(与图1-2相似)。(6)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml肿瘤细胞裂解后的内容物，对γδt细胞进行刺激。(8)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(9)14天后，抽取1×106的细胞进行γδt细胞进行流式检测，抽取8×106的细胞对k562细胞进行杀伤活性检测，抽取部分消培养液检测il-4和ifn-γ的表达量。实施例3：(1)采集志愿者20ml血液；(2)离心后收集血浆；(3)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有ficoll分离液(购至stemcell公司)的sepmate离心管(购至stemcell公司)中，离心10-20min；(4)离心后将上层液体从离心管中倒出，再加入一定量的生理盐水重悬细胞，离心；(5)按照1-2×106的细胞密度加入xvivo-15培养基进行培养，并在培养基中加入100μg/ml的okt-3和100u/ml的il-2。每日观察γδt细胞的形态(与图1-2相似)。(6)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml肿瘤细胞裂解后的内容物，对γδt细胞进行刺激。(8)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(9)14天后，抽取1×106的细胞进行γδt细胞进行流式检测，抽取8×106的细胞对k562细胞进行杀伤活性检测，抽取部分消培养液检测il-4和ifn-γ的表达量。实施例4：(1)采集志愿者20ml血液；(2)离心后收集血浆；(3)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有ficoll分离液(购至stemcell公司)的sepmate离心管(购至stemcell公司)中，离心10-20min；(4)离心后将上层液体从离心管中倒出，再加入一定量的生理盐水重悬细胞，离心；(5)按照1-2×106的细胞密度加入xvivo-15培养基进行培养，并在培养基中加入50μg/ml的okt-3和1000u/ml的il-2。每日观察γδt细胞的形态(与图1-2相似)。(6)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml肿瘤细胞裂解后的内容物，对γδt细胞进行刺激。(8)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(9)14天后，抽取1×106的细胞进行γδt细胞进行流式检测，抽取8×106的细胞对k562细胞进行杀伤活性检测，抽取部分消培养液检测il-4和ifn-γ的表达量。实施例5：(1)采集志愿者20ml血液；(2)离心后收集血浆；(3)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有ficoll分离液(购至stemcell公司)的sepmate离心管(购至stemcell公司)中，离心10-20min；(4)离心后将上层液体从离心管中倒出，再加入一定量的生理盐水重悬细胞，离心；(5)按照1-2×106的细胞密度加入xvivo-15培养基进行培养，并在培养基中加入50μg/ml的okt-3和500u/ml的il-2。每日观察γδt细胞的形态(与图1-2相似)。(6)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml肿瘤细胞裂解后的内容物，对γδt细胞进行刺激。(8)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(9)14天后，抽取1×106的细胞进行γδt细胞进行流式检测，抽取8×106的细胞对k562细胞进行杀伤活性检测，抽取部分消培养液检测il-4和ifn-γ的表达量。实施例6：(1)采集志愿者20ml血液；(2)离心后收集血浆；(3)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有ficoll分离液(购至stemcell公司)的sepmate离心管(购至stemcell公司)中，离心10-20min；(4)离心后将上层液体从离心管中倒出，再加入一定量的生理盐水重悬细胞，离心；(5)按照1-2×106的细胞密度加入xvivo-15培养基进行培养，并在培养基中加入50μg/ml的okt-3和100u/ml的il-2。每日观察γδt细胞的形态(与图1-2相似)。(6)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml肿瘤细胞裂解后的内容物，对γδt细胞进行刺激。(8)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(9)14天后，抽取1×106的细胞进行γδt细胞进行流式检测，抽取8×106的细胞对k562细胞进行杀伤活性检测，抽取部分消培养液检测il-4和ifn-γ的表达量。对比例1(1)采集志愿者20ml血液；(2)离心后收集血浆；(3)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有ficoll分离液(购至stemcell公司)的sepmate离心管(购至stemcell公司)中，离心10-20min；(4)离心后将上层液体从离心管中倒出，再加入一定量的生理盐水重悬细胞，离心；(5)按照1-2×106的细胞密度加入xvivo-15培养基进行培养，并在培养基中加入50μg/ml的okt-3和100u/ml的il-2。每日观察γδt细胞的形态(图1-1)。(6)以后每隔两天补加一定的细胞培养液和细胞因子。(7)第6天，收集所有的γδt细胞与在8kgry的条件下辐照4小时后的k562细胞共培养，γδt细胞与k562细胞的比例为10:1。(8)14天后，抽取1×106的细胞进行γδt细胞进行流式检测，抽取8×106的细胞k562细胞进行杀伤活性检测，抽取部分消培养液检测il-4和ifn-γ的表达量。试验例1流式细胞仪检测γδt细胞表面标志物取实施例1、对比例1分选后及共同培养后的γδt细胞进行cd56和cd3的流式检测。流式检测方法如下：取1×106个γδt细胞；250g离心5min去上清；用含10％fbs的pbs溶液清洗2次；避光加入cd56和cd3抗体2.5μl室温孵育30min；用含10％fbs的pbs溶液清洗2次；用500mlrpmi1640培养基重悬细胞并过滤，上流式细胞仪进行检测(图2)。结果显示，对比例中cd56+和cd3+双阳性表达率比所有实施例组都低，且差异具有统计学意义。试验例2检测γδt细胞的杀伤活性对上述实施例1-6和对比例1收集的γδt细胞的共培养物进行杀伤活性检测。铺板时各实验孔和对照设置如下：实验孔：按效靶比40:1、20:1和10:1进行靶细胞(k562)和效应细胞(实施例1-3得到的共培养物)的铺板。其中，效应细胞的浓度分别为4×106个/ml，2×106个/ml，1×106个/ml，每孔100μl，每组3个复孔；k562浓度为1×105个/ml，每孔100μl，每组3个复孔。效应细胞自然释放孔：4×106个/ml，2×106个/ml，1×106个/ml，每孔100μl，每组3个复孔，每孔加入100μl培养基。靶细胞最大释放孔：1×105个/ml的靶细胞，每孔100μl，每组3个复孔，每孔加入100μl培养基，于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育前45min每孔加入20μl细胞裂解液。靶细胞自然释放孔：1×105个/ml的靶细胞，每孔100μl，每组3个复孔，每孔加入100μl培养基。培养液空白对照：每孔200μl培养液，每组3个复孔。体积纠正对照：每孔200μl培养液，每组3个复孔，于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育前45min每孔加入20μl细胞裂解液。铺板后将培养板250g离心4min，置于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育4h。在培养结束前45min，取出培养板，在靶细胞最大释放组和体积纠正组每孔加入20μl细胞裂解液，250g离心4min，继续培养45min后取出。进行ldh(乳酸脱氢酶)测定，具体步骤如下：250g离心4min，每孔吸出50μl上清转移到另一新的96孔板中，每孔加底物溶液50μl，室温避光孵育30min。每孔加入50μl终止液，用振荡器将色素颗粒打散，测定490波长处的吸光度值。试验组、靶细胞ldh自然释放组和效应细胞ldh自然释放组的吸光度均值减去培养液空白对比例吸光度值均值，获得校正值。靶细胞ldh最大释放组的吸光度均值减去体积纠正组吸光度值均值，获得校正值。杀伤活性按如下公式计算：活性＝(a-e-t)/(tmax-t)×100％………………(1)a:试验组吸光度值校正值，e:效应细胞自然释放孔吸光度值校正值，t：靶细胞自然释放孔吸光度值校正值，tmax：靶细胞最大释放组吸光度值校正值。检测结果见表1。表1γδt细胞对k562细胞的杀伤活性检测结果效靶比40:120:110:1实施例146.96％35.20％12.50％实施例252.30％42.10％15.30％实施例358.21％43.12％19.24％实施例449.52％35.90％14.23％实施例554.20％40.27％16.2％实施例651.23％34.20％17.65％对比例125.60％15.90％6.50％试验例3检测γδt细胞的il-4和ifn-γ的表达量(1)将巨噬细胞培养后的细胞培养液收集起来进行浓缩，为实验品；分别将ifn-γ和il-4标准品溶解，分别设置了5个浓度，分别是10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml、40μg/ml及50μg/ml；从已恢复到室温的密封袋中取出实验所需板条；(2)留空白孔，提前30min制备生物素化抗体工作液，于10℃～35℃下避光放置；(3)分别将实验品或不同浓度的标准品(0μg/ml孔加试剂稀释液)加入相应孔中，100μl/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90min；(4)洗板4次：(5)除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μl/孔。用胶纸封住反应孔，于37℃孵箱避光孵育60min；(6)洗板4次；(7)除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μl/孔。用胶纸封住反应孔，于37℃孵箱避光孵育30min；(8)洗板4次；(9)加入显色底物，100μl/孔，于37℃孵箱避光孵育15min：(10)加入终止液，100μl/孔，混匀后检测其吸光度值(od450值)。检测结果见表2。表2ifn-γ和il-4含量以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12