猪DNAH2基因分子标记在肉质检测中的应用的制作方法

本发明属于家畜分子生物学
技术领域：
，涉及一种多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法。
背景技术：
：猪肉是我国城乡居民动物性蛋白的主要来源，随着人们对肉品需要量的增加，对肉质的要求也相对提高。而肉质主要是由微效多基因控制，并存在主基因效应。分子生物技术的发展，尤其是近年来基因组测序技术的发展，使得人们可以在dna水平寻找控制肉质性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，并在育种过程中将其应用于标记辅助选择，以提高选择进程，更好地改善猪肉质性状，满足人们的需要，以获得更大的经济效益。肉质定义最为广泛接受的是hoffmarm的定义，即肉质应该考虑感官属性、营养价值、技术质量和食品安全。感官属性指外观(如色泽)、保水力、硬度，食用品质指嫩度、多汁性、风味与滋味、臭味、大理石纹，营养价值指脂肪含量、脂肪酸组成、蛋白质含量、其它营养含量，技术因素指系水力、脂肪硬度、组织分离、氧化稳定性，社会质量指动物福利、环境，食品安全指微生物卫生(无沙门氏菌、弯曲杆菌)、无残留(抗生素、重金属、杀虫剂)。影响猪肉质的因素很多，有遗传因素和非遗传因素，从遗传上对猪肉质性状进行评定和选育是改善猪肉品质的关键，肉质性状大多属于数量性状，由微效多基因控制，某些数量性状存在主基因效应，大多数属于qtl。许多肉质性状只能在动物屠宰后才能测定，所以常规选育只能寄予同胞或半同胞测验，这就势必加大选育成本，且遗传进展缓慢。肉质性状只能在动物屠宰时才能测定，需昂贵的同胞测验，因此，利用分子标记进行辅助选择(mas)控制肉质性状是非常有意义的。分子生物技术的发展和猪高密度基因图谱的构建，使育种工作者可在dna水平上寻找影响肉质性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，理论上这些主基因或分子标记一经确认，就可进行标记辅助选择育种。纤毛的运动是很多单细胞(如衣藻和精子)的马达，为细胞在水环境中的定向运动提供动力。它可以拨动表面的液体来发挥功能。呼吸道上皮细胞纤毛的摆动可以排出呼吸道的灰尘和细菌，如相应基因突变将导致纤毛的运动失活。人的精子鞭毛和输卵管的纤毛缺陷将导致其生育能力的下降。有研究还表明，纤毛还加强与肉质有密切关系的经典wnt信号通路。纤毛轴动力蛋白重链2基因(dyneinaxonemalheavychain2，dnah2)位于猪12号染色体，位于人(homosapiens)17p13.1，该基因编码纤毛轴动力蛋白重链2蛋白，由4427个氨基酸组成，其分子量为507698da。该蛋白从n端到c端依次为：动力蛋白茎干，aaa-6，aaa2，aa3，tpr2，aaa4，p-loop-ntpase(此结构中含有三磷酸核苷水解酶，其发挥作用水解产生能量，带动微管间相互移动，从而导致纤毛的运动)，stalk，mt(动力蛋白微管结合茎)，aaa5，重链和动力蛋白区d6等11个区域。小鼠(musmusculus)11号染色体，大鼠(rattusnorvegicus)10号染色体，猪该基因(genbank收录号为xm_013981316)预测的cdna长度为7437bp。但是，目前国内外关于猪dnah2基因的相关研究没发现相关报道。据此推断，该基因有可能通过改变猪肌肉中的肌纤维的运动影响失水率，进一步影响肉的品质。技术实现要素：本发明的目的在于寻找dnah2基因的突变位点以及作为猪肉质性状基因多态性的检测方法，为标记辅助育种提供一种有用的分子标记。本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种猪肉质性状相关基因dnah2及其在猪标记辅助选择中的应用，为猪标记辅助选择提供有用的分子标记。为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：一种猪肉质性状相关基因dnah2在猪分子标记辅助选择中的应用，该猪肉质性状相关基因dnah2基因的dna序列如序列表seqidno:1所示，在第504bp处有一个c/g的碱基突变，导致pcr-rflp-acci多态性。上述dnah2基因的多态性是以猪的基因组dna为模板扩增，扩增片段利用sscp技术和测序技术发现snp，并利用pcr－rflp进行基因分型，再利用sas软件通用线性模型(generallinearmodel,glm)分析snp与肉质性状的关联。本发明制备了检测seqidno:1所示的dnah2基因片段突变的引物对，所述引物对的序列为：正向引物为5′-tgatgctcgtgagtgaaaga-3′。反向引物为5′-aggactgggtggaggaaat-3′。利用上述制备的与猪肉质性状相关的分子标记对外来猪种和中国地方品种进行了关联分析的应用，从而完成了本发明。snp发现与检测方法建立：申请人设计了扩增包含该snp引物，dnah2基因引物扩增的pcr产物经过限制性内切酶acci酶切后产生3个不同长度大小的片段，分别为1033bp、504bp、529bp。经过2％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。图中看到的只有一条电泳条带的是cc基因型，大小为1033bp；两条带的是gg基因型，大小分别为504bp和529bp；三条带的是gc基因型，大小分别是504bp、529bp和1033bp。基因型－肉质性状间关联：利用sas软件中的一般线性模型(generallinearmodel,glm)程序对基因型与性状进行关联分析，模型如下为yijkn＝μ+hi+lj+gk+εijkn，yijkn为性状表型值，μ为总体均数，hi为猪场效应，lj为年代效应，gk为dnah2基因型不同位点的效应，εijkn为随机误差效应，服从正态分布(0,σ2)。分析表明dnah2基因snp位点对肉质性状的失水率有显著影响(p<0.05)。本发明将为猪肉质性状的分子标记，为标记辅助选择(mas)奠定坚实的基础，进一步阐明肉质性状的分子机制，将为改善猪肉品质提供理论依据，提高养猪生产经济效益，并指导猪的育种实践。附图说明图1是本发明的dnah2基因c/g位点的acci酶切电泳结果。注：m为marker道，1、2、3、4、6、8、9、11、12为cc型，5、10为gg型，7为gc。图2是猪dnah2基因突变位点的测序峰图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施并不对本发明做任何限定。实施例1：pcr-rflp技术检测dnah2基因的acci多态性。引物设计：利用比较基因组学方法根据猪的dnah2基因(genbank收录号为xm_013981316)，在genbank作blast序列比对后筛选出dnah2基因候选snps位点，设计特异性引物，用这些引物来扩增从猪耳组织提取的基因组dna。引物为：f：5′-tgatgctcgtgagtgaaaga-3′，r：5′-aggactgggtggaggaaat-3′。试验中所采集的猪耳样品主要来源于正虹原种猪场和中国地方品种猪种猪场。dnah2基因实验部分样品来源于4个猪种共298头，其中正虹原种猪场大白猪91头，中国地方品种猪宁乡猪72头，沙子岭猪71头，桃源黑猪64头。用剪耳钳剪取试验猪小块耳样组织装入灭菌消毒后的1.5mleppendorf管中，加入适量70％的酒精，放于-20℃保存，备用于提取dna。pcr条件：pcr反应体系(总体积20μl)：10×buffer2μl，2mmol/ldntps1.6μl，20mmol/lmgcl21.6μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.4μl，dna模板(100ng/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.4μl，ddh2o12.6μl。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃后延伸10min，最后4℃保存。取10μlpcr扩增产物，加2μl溴酚蓝上样缓冲液混匀后，点样于2％的琼脂糖凝胶(含0.05％eb)上，然后点6μl100bpdnamarkers作为参照。5v/cm电泳0.5～1.0h。电泳结束后在凝胶成像系统中观察扩增结果并拍照。将纯化后的pcr产物送铂尚生物技术公司测序。pcr产物的acci酶切：在10μlpcr产物中加入8μl10×内切酶缓冲液、0.2μl限制性内切酶和2μl双蒸水，总体积为20.2μl，37℃消化10h。c/g位点用1％琼脂糖凝胶电泳分析，5v/cm电压电泳0.5h，紫外灯下观察结果并拍照，酶切结果如图1，图1是本发明中dnah2基因pcr-rflp的3种基因的cc、cg和gg电泳结果。图中m：dna分子量标准(dl100bpladder)。图2是突变位点的测序峰图。本发明以猪dnah2基因作为猪肉质性状的候选基因，以3个地方猪种(宁乡猪、桃源黑猪和沙子岭猪)和大白猪为实验材料，采用pcr-rflp方法对dnah2基因c/g位点的基因频率、基因型频率进行检测，并分析其遗传结构，分析该基因与肉质性状的相关性。实施例2：dnah2基因多态性在不同猪种中的分布统计dnah2基因g/c突变位点在不同品种猪的基因频率、基因型频率，并对其结果进行适合性卡方检验。结果如表1所示，从表中可看出4个品种猪均存在多态性，且c基因的等位基因频率均高于g等位基因频率，二者相差大小分别为0.2112、0.7746、0.6666、0.0626。由此得知，在大白猪、宁乡猪、桃源黑猪中，c基因为优势基因，cc基因型为优势基因型。适合性卡方检验发现桃源黑猪的χ2<χ20.05，p>0.05，表明二者处于hardy-weinberg平衡状态。大白猪和宁乡猪的检验值χ2>χ20.001，p<0.001，则二者群体处于连锁不平衡状态，且差异极显著(p<0.01)。表1dnah2基因突变位点基因型频率和基因频率注：1.标有*号的数值显著差异水平为0.05；标有**号的数值显著差异水平为0.001(下同)通过计算统计对于dnah2基因g/c突变位点，各品种猪的遗传纯合度、有效等位基因数和多态信息含量，结果如下表2。结果表明，在所选的4个品种猪中，遗传纯合度均高于0.5，其中沙子岭猪遗传纯合度最高，为0.8，桃源黑猪对低，为0.502。地方品种猪除桃源黑猪外的遗传纯合度均高于外来猪种大白猪。有效等位基因数是遗传纯合度的倒数，则沙子岭猪有效等位基因最低，桃源黑猪反而最高。从多态信息含量数据来看，各品种猪均处于0.5以下，大白猪和桃源黑猪的多态信息含量在0.25-0.5之间，属于中度多态性，该位点遗传多态性丰富。而沙子岭猪和宁乡猪多态信息含量均处于0.25以下，表现为低多态性。表2dnah2基因突变位点在不同品种猪中的遗传多态性分析品种遗传纯合度遗传杂合度有效等位基因数多态信息含量大白猪0.52230.47771.91460.3636沙子岭猪0.80000.20001.25000.1800宁乡猪0.72220.27781.38470.2392桃源黑猪0.50200.49801.99200.3740实施例3：dnah2基因多态性与肉质性状关联分析对正虹种猪场72头大白猪进行屠宰，测定其屠宰率、背膘厚、眼肌面积、肉色等级、大理石纹、ph值、失水率和熟肉率8个肉质性状指标，并对dnah2基因突变位点不同基因型与这些肉质性状指标进行多重比较及显著性分析，结果如下表3所示。从表中可看出，屠宰率、肉色等级、大理石纹、ph值和熟肉率不同基因型间不存在差异性(p>0.05)。由背膘厚和眼肌面积来看，cc型与gc型、gg型差异性不显著(p>0.05)，而gc型与gg型呈显著性差异(p<0.05)。在失水率方面，gg型均显著高于cc型和gc型(p<0.05)，而cc型和gc型之间差异不显著(p>0.05)。表3dnah2基因多态性与肉质性状关联分析注:同行中不同字母表示差异显著(p<0.05)。<110>湖南农业大学<120>猪dnah2基因分子标记在肉质检测中的应用<130><160>1<170>patentinversion3.1210>1<211>1033<212>dna<213>猪（susscrofa）<220><221>mutation<400>1tgatgctcgtgagtgaaagagctgcgattggaatggccgttgtcggcctctcaagccagt60gctcttttgctgtgtcc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