一株喜温酸硫杆状菌的应用的制作方法

本发明属于微生物治理重金属污染技术领域,具体涉及一株生长迅速、对土壤镉生物转化效率高的喜温酸硫杆状菌新菌株的应用。

背景技术：

土壤是生态环境的重要组成部分，在各类环境要素中，例如水污染、大气污染严重的地区，随着水流、降雨、大气流动等自然现象，污染物最终进入土壤，逐渐转化为土壤污染，使土壤成为污染物的最终受体。重金属在土壤中的吸附和聚集等作用，逐渐导致土壤中重金属含量严重超标，土壤内源污染严重。当前，土壤污染导致的不良影响备受关注，成为了环境治理的热点，采用微生物修复土壤中cr、cd、pb等重金属不但具有耗能少，操作简单等优点，同时也是一种环境友好型的可持续发展的治理手段。

acidithiobacilluscaldus是一种无机化能自养型的杆状微生物，属于革兰氏阴性菌。主要与硫化矿系的生物浸出息息相关，其对矿石微生物浸出的机制为直接作用，喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldus)吸附在矿物表面，通过蛋白分泌物或其他代谢产物直接将硫化矿氧化分解，使硫化矿的晶格破坏，分解成为金属离子和硫单质，喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldus)再进一步将硫单质氧化生成硫酸。

acidithiobacilluscaldus将硫单质氧化成硫酸，有助于还原土壤中的重金属，促进重金属的溶解，同时产生的硫酸降低土壤的ph，使土壤中阳离子交换能力减弱，进而使金属和土壤成分静电吸引力减弱，降低土壤对金属的吸附能力，使其溶解在溶液中，有助于土壤重金属污染的治理。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种喜温酸硫杆状菌新菌株在土壤中镉的生物转化上的应用。该菌株生长迅速、产酸能力强，并能对土壤中铁锰结合态镉变成小分子可溶性镉进行高效的生物转化，为微生物在环境治理和生物冶金等方面的高效开发利用提供技术指导。

一株喜温酸硫杆状菌的应用，利用该菌株dx-csu将土壤中的镉去除，该菌株命名为acidithiobacilluscaldus，保藏编号为cgmccno.14008。具体是利用该菌株将土壤中铁锰结合态镉转变成小分子可溶性镉。

作为进一步的改进，将9k培养基培养的菌浓为1×10⁸～1×10⁹cell/ml的菌液以固液质量体积比为1g:10ml添加至镉污染土壤的锥形瓶中，培养6d以上。

本发明所提供的喜温酸硫杆状菌是喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldus)dx-csu，保藏编号为cgmccno.14008。

所述的acidithiobacilluscaldusdx-csu的筛选方法如下：：

(1)将德兴采集的矿样加入内装100ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中；

(2)将步骤(1)的三角瓶放置恒温摇床中培养；

(3)从步骤(2)中取悬浊液加入9ml无菌水中，依次稀释10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10倍；

(4)取步骤(3)悬浊液1ml加入100ml灭菌的改良的9k培养基中，置于45℃恒温箱中培养0.5d、1d和3d；

(5)将步骤(4)每个浓度重复3次；

(6)将(3)至(5)步骤重复4-5次。

acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株16srrna基因序列测序结果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的16srrna基因序列见序列表，根据测序结果与genbank中喜温酸硫杆状菌16srrna基因序列进行同源性比较，结果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu属于喜温酸硫杆状菌。

acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株全基因组基因序列测序结果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的全基因序列与genbank中喜温酸硫杆状菌全基因序列进行同源性比较，结果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu是一个新的菌株。

本发明的喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的培养基，其为改良的9k培养基，包含：k2hpo40.5g/l；ca(no3)2·4h2o0.01g/l；kcl,0.1g/l；mgso4·7h2o0.5g/l；(nh4)2so43.0g/l，1000ml蒸馏水；用稀h2so4调ph值至2.5，加入0.2％的硫粉作为能源物质。

本发明的喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的培养方法，采用上述的培养基，接种的喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)浓度为1.0×10⁶个/毫升，初始ph值为2.5，培养温度为45℃，摇床转速170rpm。

本发明提供的一株喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)生长迅速、产酸能力强，对土壤镉生物转化效率高，有助于解决环境中重金属污染问题，以及生物冶金技术中低品位矿石的金属生物浸出。

本发明喜温酸硫杆状菌株dx-csu命名为喜温酸硫杆状菌acidithiobacilluscaldus，保藏编号为cgmccno.14008，于2017年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理文员会普通微生物中心(cgmcc)。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为四株不同种的喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldus)培养基溶液ph随时间变化；

图2为四株不同种的喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldus)培养基溶液eh随时间变化；

图3为四株不同种的喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldus)培养基中菌浓度随时间变化；

图4为acidithiobacilluscaldusdx-csu作用下土壤溶液中铁锰结合态镉的变化；

图5a为基于喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldus)不同菌株的全基因组构建的系统发育树；

b为acidithiobacilluscaldusdx-csu全基因组草图。

具体实施方式

以下结合实施例只在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的分离

喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的分离从德兴地矿石采集矿样10g，加入内装100ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，于170r/min摇床上振荡20min，取1ml加入9ml无菌水中，依次稀释10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10倍，分别取以上悬浊液1ml加入100ml灭菌的9k培养基中，每个浓度重复3次，置于45℃恒温箱中培养0.5d、1d和3d，重复4-5次上述步骤对细菌进行分离和纯化。

实施例2、喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)的鉴定

(1)acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株16srrna基因序列测序结果显示acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的16srrna基因序列见序列表，根据测序结果与genbank中喜温酸硫杆状菌16srrna基因序列进行同源性比较，结果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu属于喜温酸硫杆状菌。

(2)acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株全基因组基因序列测序结果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu菌株的全基因的测序结果与genbank中喜温酸硫杆状菌全基因序列进行同源性比较，结果表明acidithiobacilluscaldusdx-csu是一个新的菌株。

实施例3、喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldus)的生理性质

比较了本实验室筛选的四株不同种的喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldus)培养基溶液ph和eh随时间变化；其结果表明本发明的喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)ph明显低于其他三种，同时结果表明本发明的喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)eh明显高于其他三种，说明本发明菌株产酸能力强。见说明书附图1，2。

比较了四株不同种的喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldus)培养基中菌浓度随时间变化；其结果表明本发明的喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)生长速度明显快于其他三种。见说明书附图3。

实施例4、喜温酸硫杆状菌(acidithiobacilluscaldusdx-csu)在cd污染土壤中生物去除效率实验

(1)采集镉污染土壤作为供试土壤，混合均匀后，选取部分测量该土壤中原始铁锰结合态镉的浓度。

(2)9k培养基121℃灭菌30min，将菌液(菌浓为1×10⁸～1×10⁹cell/ml)以固液质量体积比为1g:10ml添加至含供试土壤的锥形瓶中，培养6d，分别于培养的2d，4d，5d，6d测量土壤中铁锰结合态，结果表明，acidithiobacilluscaldusdx-csu能有效降低土壤中铁锰结合态镉含量,生物去除率可达到49.5％，明显高于其余三株菌。见说明书附图4。

sequencelisting

<110>中南大学

湖南省农业生物技术研究中心

<120>一株喜温酸硫杆状菌的应用

<130>无

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1402

<212>dna

<213>acidithiobacilluscaldusdx-csu16srrna序列表

<400>1

cgtcgcccccccgaaggttaggctaacggcttctggtaccatccactcccatggtgtgac60

gggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattacta120

gcgattccgacttcatgcagtcgagttgcagactgcaatccgaactacgacgcgctttct180

ggggtctgctccacctcgcggcttggcttccctctgtacgcaccattgtagcacgtgtgt240

agccctggacataaaggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtca300

ccggcagtctccctagagtgcccggccgaaccgctggcaactaggaacaagggttgcgct360

cgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctg420

tgttccgattccccgaagggcacccccacatctctgcagggttccggacatgtcaagccc480

aggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggccc540

ccgtcaattcctttgagttttaaccttgcggccgtacttcccaggcgggatacttatcgc600

gttagctacgacactcagcacctaaggcgccaaacatccagtatccatcgtttagggcgt660

ggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagtat720

tgggccaggtgaccgccttcgccactggtgttcctccagatctctacgcatttcaccgct780

acacctggaattccatcaccctctcccatactccagtcagcccgtttccaccgccattcc840

caggttgagcccggggatttcacggcagacgtaacccaccgcctacgcgccctttacgcc900

cagtaattccgattaacgctcgcaccctccgtattaccgcggctgctggcacggagttag960

ccggtgcttcttcttgggttcacgtcaatagcagaccgtattcggatccgccttttcgtc1020

ccccacgaaaggactttacaacccgaaggccttcttcatccacgcggcattgcttcgtca1080

gggttgcccccattgcgaaaaattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgt1140

ctcagtcccagtgtggctggtcgtcctctcagaccagctaccgatcgtcgccttggtagg1200

cctttaccccaccaactagctaatcggacgtaggcccctccttcagcacgaggtccgaag1260

atcccccgctttccccctcagggcttatgcggtattagcccaagtttccctgggttgtcc1320

cccacaaaaggataggttcctacgcattactcacccgtccgccactcgccagcatcccga1380

aggacctgctgccgtccgactg1402