水稻根特异表达启动子POsRO4及相应水稻培育方法与流程

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻根特异表达启动子posro4的克隆及利用其进行转基因水稻培育的方法。

背景技术：

高等生物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用的过程。启动子作为一个重要的调控元件，通过和众多转录因子的结合进而决定了基因的表达模式与表达强度。

通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中具有很好的应用前景。在近年的时间里，植物基因工程的研究取得了突飞猛进的进展，已经成为作物遗传改良和基因功能研究中的一项重要方法和手段。但是在其广泛运用的过程中也逐渐暴露了一些问题。其中之一就是现阶段研究中经常用组成型表达启动子来驱动目的基因表达。尽管组成型启动子能高效、非特异性的启动外源基因表达，但这种外源基因的组成型表达往往会造成大量异源蛋白的积累，从而打破植物原有的代谢平衡，妨碍植物的正常生长。例如生长迟缓、生长期长、甚至不育和死亡。因此，需要寻找更为有效的特异启动子来调节外源基因的表达。组织特异性启动子使基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位，不仅能使目的基因的表达产物在该器官或组织积累，增加区域表达量，同时可避免植物体内不必要的营养浪费，减少对植物生长的副作用，因此具有一定的应用价值。

水稻作为人类最重要的粮食作物之一，其产量的高低对人类生活，经济具有重要的影响，而病虫害及逆境常常造成水稻大量减产，因此利用基因工程技术改良水稻，使其获得抗病、抗虫能力以及对环境的耐受性是提高水稻产量的有效途径之一。要使外源基因有效、合理、稳定的表达,需要有相应的启动子来驱动。根是水稻吸收水分和营养物质的重要器官，根特异表达系统可用于研究植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。目前在植物中，虽然已有少数根部特异表达的启动子被克隆并应用于基因功能的研究，但在一个载体中重复使用同一个启动子易造成转基因沉默，由此可见，有必要去发展更多的水稻等禾谷科作物的根特异型启动子，这对基础性研究和遗传改良应用都具有重要的意义。

水稻发育的最重要的器官并非种子，而是根部，水稻的根毛部位是水稻根系发挥其作用的最重要的一个部位，现有的根特异启动子，往往是在整个水稻的根系发挥作用，而实际上，根毛部位和根主干部位所起到的作用还是具有很大差异的，因此，若是能够提供一种仅在水稻根毛部位表达，而在其他部位，不表达的启动子，则可以在减少植物代谢负担的情况下，而实现对植物的特异性调控。

但是目前现有的文献中，均未见到有根毛特异性表达启动子的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种水稻根特异表达基因posro4的启动子，利用该启动子能驱动外源基因在水稻根组织中特异表达。

为了解决上述技术问题，本发明提供水稻根特异表达基因posro4的启动子，其特征在于，该启动子包含seqidno：1所示的核苷酸序列。

优选地，所述启动子还包括1)在高严谨条件下可与seqidno：1所示的核苷酸序列杂交、且具有启动子功能的核苷酸序列；或者

2)与1)限定的dna序列与seqidno：1所示的dna序列有至少80％的同源性，且具有启动子功能的核苷酸序列；或者

3)在seqidno：1中所示的核苷酸序列中取代、缺失或添加一个或插入多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供一组扩增所述核苷酸序列的全部或其任意片段的引物对。

优选地，正向引物的核苷酸序列如seqidno：2所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno：3所示。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含所述的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供一种重组表达载体，其特征在于，其为在植物表达载体的多克隆位点插入所述的核苷酸序列得到的重组质粒，所述核苷酸序列连接于载体中待表达基因序列的上游。

另一方面，本发明提供一种所述的启动子posro4在驱动目标基因在植物中根特异性表达方面的应用。

另一方面，本发明提供一种转基因水稻培育方法，其特征在于，所述方法包括：(1)获取权利要求1所述的启动子posro4；

(2)将步骤(1)中所获得的启动子连接至具有改善根功能的目标基因，获得重组表达载体；

(3)将所述重组表达载体转入目标水稻种子；

(4)利用所述目标水稻种子进行水稻植株的培育。

在一种实现方式中，所述待表达的基因为gus基因。该重组表达载体为将seqidno.1所示的序列即posro4或启动子posro4。构建于pcambia1381中得到的重组表达载体，本文中称为pcambia1381-posro4。或者待表达基因可以为任何对水稻根组织具有改善功能的基因。

优选地，所述待表达基因为具有改善水稻根组织性状能力的基因。

另一方面，本发明提供一种所述的水稻根表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述水稻根表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

进一步地，所述应用用于改良植物生长特性，特别是根部的生长及改良。

序列表中seqidno.1所示的dna序列为来源于日本晴水稻(oryzasativalcv.nipponbare)的根特异性强表达启动子，本文中称为posro4或启动子posro4。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻基因上游包括转录起始位点在内的1972bp的dna序列，具有驱动目标基因水稻根中特异性表达的功能，并且分离克隆、鉴定该dna序列的功能。

技术效果

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经遗传转化后，在水稻的根部位(尤其是根毛部位)特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，避免不必要部位表达带来的物质能量浪费，有效改良水稻的特性，在实际应用中具有显著价值，如通过该启动子驱动目标基因在植株根中表达，可以增强根发育过程中对环境的抵抗力，比如耐寒性、耐热性等等；或提高根部吸收营养和水分的能力；或提高根部抵抗害虫的能力，从而培育出理想的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将启动子posro4构建于pcambia1381载体质粒中的示意图，其中图a为pcambia1381示意图，图b为pcambia1381-posro4示意图，其中示出了利用posro4启动子驱动位于其下游的gus基因表达。

图2为对本发明的pcambia1381-posro4表达载体进行酶切验证的结果示意图。

图3为对获得的posro4：：gus转基因水稻植株pcr检测电泳图，m:dnamarker2000；pc，阳性质粒；nc，阴性对照植株；1-16:pcambia1381-posro4转基因水稻潮霉素hpt基因pcr产物。

图4为对获得的posro4：：gus转基因阳性水稻植株进行gus染色结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、根特异表达启动子的获得

一、根特异性表达启动子的获得及表达载体构建

根据ncbi中提供的水稻品种日本晴(oryzasativalcv.nipponbare)全基因组序列，利用primer5引物设计软件依据水稻posro4启动子的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点，引物序列如下：

fp：gtcgacgagagcaggacagcgcaactaa

rp:gaattcttttaatctatatttttttcct

其中gtcgac碱基为限制性内切酶sali的识别位点及保护碱基；gaattc碱基为限制性内切酶ecori的识别位点及保护碱基。

采用天根公司(北京)的植物dna提取试剂盒方法提取水稻基因组dna。以基因组dna为模板，利用正向引物、反向引物，采用phusion高保真dna聚合酶，按常规pcr体系，采用如下扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。回收pcr产物，并按照说明书，将其连接至t‐载体中。连接产物转化至大肠杆菌中，在含有卡那霉素的lb培养基上进行培养24小时。待长出单个克隆后，对单个克隆进行pcr筛选，挑出阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，送去北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，并与ncbi中该启动子序列比对。测序结果表明，pcr产物具有序列表的序列，末端第1至1796位核苷酸所示的dna片段，并将序列表的序列末端第1至1796位核苷酸所示的dna片段命名为posro4。

用限制性内切酶sali和ecori酶切植物表达载pcambia1381，回收线性化载体骨架(约10657bp)。

将posro4的酶切回收产物与载体骨架线性化片段用progemat4连接酶连接(10×t4ligasebuffer1μl，t4ligase1μl，目的片段2μl，pcambia1381质粒大片段6μl)，4℃冰箱过夜连接16-18h，得到连接产物重组质粒，并将连接产物转化大肠杆菌。经过菌落pcr筛选重组子和双酶切验证正确的(酶切验证结果如图2所示)，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序并将测序。测序正确的重组子，提取其质粒，利用冻融法将其转化至农杆菌eha105中，挑取阳性的菌落摇菌，并用甘油保存菌液备用。至此，获得含有pcambia1381‐posro4表达载体的农杆菌，用于水稻遗传转化。

实施例2、农杆菌介导的水稻遗传转化

(1)愈伤组织诱导消毒后的种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上。每皿(规格为100×25mm的一次性塑料培养皿，内含50ml诱导培养基)均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤。

(2)预培养从诱导培养基上挑选颗粒状、不带病斑的愈伤组织置于新的诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3～5d。

(3)侵染及共培养将预培养的愈伤组织转移至50ml无菌管中，加入表达载体的农杆菌菌液浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将残余菌液吸干。后将愈伤均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗条件下培养2～3d。

(4)恢复将共培养的愈伤转移至恢复培养基上(愈伤之间尽量避免重叠)。23℃黑暗培养3～5d。

(5)筛选从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的抗性胚性愈伤组织，每皿30粒接种于筛选培养基，30℃黑暗培养2～3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤。

(6)分化每一转化事件(筛选时由一粒愈伤组织繁殖产生的所有愈伤组织)挑选三个独立的胚性愈伤到分化培养基某一区域，30℃光照培养室(16h光照/8h黑暗)条件下培养3～4周，待幼苗长出。

(7)生根每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培养室光周期(16h光照/8h黑暗)培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间。

实施例3、转基因水稻苗中启动子的特异表达

按照天根试剂盒的方法，提取实施例2转化了pcambia1381-posro4表达载体的转基因水稻叶片的dna，用潮霉素基因hpt检测引物进行扩增，挑出阳性转基因植株，结果如图3所示。

选取转基因阳性植株的组织器官，即根、茎、叶、叶鞘、花和种子分别进行gus染色(50ml0.5m磷酸缓冲液(ph7.0)，50μl100mm铁氰化钾k3fe(cn)6，50μl100mm亚铁氰化钾k4〔fe(cn)6〕·3h2o，1ml0.5medta，250μl1mg/mlx-gluc)。将各组织分别浸于gus染色液中，37℃过夜24小时。经75％乙醇脱色后，在体视镜下观察并记录gus染色的结果。结果如图4所示(标尺＝0.5cm)，在含有posro4：：gus转基因水稻植株中，只有根中有明显的蓝色，而在茎、叶、叶鞘、花和种子中没有着色。这表明posro4启动子驱动gus基因只在根部表达，由此说明，posro4启动子是根部特异表达启动子。

此外，申请人发现，从图中的深浅度对比可以看出，并且通过各部位表达量的归一化数据进行对比也可以得出，启动子在根毛部位的表达强度要比根其他部位表达强度高5倍以上，也就是说，本发明的启动子是一种在根尖的根毛部位具有特异性强表达的启动子，而根毛是根更新换代和生长最重要的器官，本发明的启动子在根毛部位的特异性强表达意义重大。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110>安徽省农业科学院水稻研究所

<120>水稻根特异表达启动子posro4及相应水稻培育方法

<130>hci20170109

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1972

<212>dna

<213>根特异表达启动子

<400>1:

gagagcaggacagcgcaactaatctctgaaaaattagtggctaggagccttggatcatag60

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<210>2

<211>28

<212>dna

<213>正向引物

<400>2:

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<211>28

<212>dna

<213>反向引物

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