一种利用木质素降解菌强化废弃生物质氨法预处理的方法与流程

技术领域：

本发明属于生物质新能源技术领域，具体涉及一种利用木质素降解菌强化废弃生物质氨法预处理的方法。

背景技术：
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当今，许多国家都在制定或调整本国能源政策，把生物质能摆在重要位置。针对我国能源分布特点，以农林废弃物为原料的第二代生物质受到重视，成为当前可替代能源之一。农林废弃物是天然的木质纤维素资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中木质素含量约为5％～30％。木质素是以苯丙烷为单元通过醚键和碳-碳键连接而成的复杂、无定形的高聚物。正是由于木质素这种天然的稳定结构使得木质纤维素生物质对化学和生物降解均具有天然的顽抗性。

为了实现对木质纤维素生物质资源的高效全利用，其关键就是通过预处理疏松或破坏纤维素的致密结构以及木质素和半纤维素对纤维素的包裹，实现对木质纤维素各组分的全分离。目前的预处理工艺主要分为物理法、化学法和生物法。其中氨法是化学碱法预处理中的常见方法，采用氨作为添加试剂，与naoh相比，对半纤维素和纤维素的破坏较小，同时还能够保证较高的木质素脱除率，且氨沸点低易于回收利用。然而，氨法预处理为了满足较好的木质素去除效果，通常需要较高的氨浓度，或增加压力，此时氨的易挥发性极大的提高了操作成本，以及对反应器密闭和操作防护的要求。因此，需要对低浓度氨法预处理进行改进，以满足木质素的高效去除能力。

真菌由于含有木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，可直接作用于木质纤维素中的木质素成分。因此，真菌法和真菌-化学联合预处理逐渐受到了关注。然而，真菌法最大的缺点就是处理时间过长(10～50天)，不利于扩大化和工业化。与真菌相比，木质素降解细菌的数量虽然较少，但可大大缩短生物处理接种时间(<7天)，因此采用细菌替代真菌进行木质纤维素预处理具有重要意义。目前，国内外尚无氨法-细菌联合预处理的相关报道。

此外，废弃生物质秸秆也就是原生木质纤维素，不仅包括木质素，还包括纤维素和半纤维素，三者紧密结合连接；其中的原生木质素高度聚合，木质素降解细菌作用原生木质纤维素时比纯的碱木质素要更加复杂，作用难度更大，因此，找寻合适的培养基成分以及条件，最大程度的去除氨法预处理渣中残留木质素也是亟待解决的问题。

技术实现要素：
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为了解决现有废弃生物质预处理技术存在的问题，本发明提供了一种利用木质素降解菌强化废弃生物质氨法预处理的方法。

本发明的技术方案为：

一种利用木质素降解菌强化废弃生物质氨法预处理的方法，包括以下步骤：

(1)氨法预处理：将废弃生物质加入氨水中，加热反应，过滤分离，所得固体清洗至ph呈中性，烘干，得到氨法预处理废弃生物质；

(2)木质素降解菌强化预处理：将保藏编号为cgmccno.4240的木质素降解菌cupriavidusbasilensisb-8接种于含氨法预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养后，过滤分离所得固体，清洗，烘干，得到细菌强化氨法预处理的废弃生物质。

步骤(1)所述的废弃生物质包括：水稻秸秆，玉米秸秆，小麦秸秆，甘蔗渣或柳枝稷等.

步骤(1)将废弃生物质粉碎后20-100目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

步骤(1)氨法预处理：将废弃生物质按固液比为1:5-1:15(g/ml)加入浓度为0.5-1％的氨水中，静置于160-200℃恒温环境中10-40min后，过滤分离，所得固体用超纯水清洗至ph呈中性，烘干至恒重，得到氨法预处理废弃生物质。

步骤(2)所述的木质素降解菌强化预处理：将木质素降解菌接种于含氨法预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养1-3天后，过滤分离所得固体，用超纯水清洗3次，烘干至恒重，得到细菌强化氨法预处理的废弃生物质。

步骤(2)木质素降解菌培养条件为菌液接种量体积比5-15％(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，温度25-40℃，自然ph条件，培养时间1-3天。

步骤(2)所述的含氨法预处理废弃生物质的无菌培养基为：氨法预处理后的废弃生物质5～15g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，kh2po41g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，cacl20.01g/l，feso4·7h2o0.015g/l，mnso4·h2o0.01g/l。

本发明提供的预处理方法的优势在于：

(1)利用木质素降解菌预处理可实现氨法预处理废弃生物质中木质素和半纤维素的深度去除，同时破坏木质纤维素结构，预处理前的直杆状结构消失，使木质纤维素表面变得十分松散，大大增加了酶解糖化时的可及表面。

(2)废弃生物质秸秆中的原生木质素高度聚合，木质素降解细菌作用时比纯的碱木质素要更加复杂，作用难度更大，本发明找寻了合适的培养基成分以及条件，最大程度的去除了氨法预处理渣中残留木质素。

(3)能够大幅提高酶解糖化效率，相比于未经预处理的木质纤维素，酶解效率提高为原来的4.3倍以上，比氨法预处理提高了约30％。

(4)具有操作简单、二次污染小、处理时间短、成本低廉等优点。

本发明所使用的木质素降解菌(cupriavidusbasilensisb-8)，保藏编号cgmccno.4240，是由本申请人筛选的已经做过专利保藏和专利申请的菌株。

附图说明:

图1：实施例中预处理后木质纤维素糖产量变化；

图2：实施例中预处理后木质纤维素各组分变化；

图3：实施例中预处理的木质纤维素预处理前后扫描电镜分析。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。

实施例1

(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

(2)将木质纤维素置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为0.5％的氨水溶液，静置于160℃恒温环境中30min后，过滤分离得到湿渣a。

(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣a，直至冲洗液ph呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣b。

(4)将保存在lb固体平板上的cupriavidusbasilensisb-8菌体接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm处的光密度达到0.8-1.0)，得到cupriavidusbasilensisb-8的种子液；其中所述lb固体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15g/l，蒸馏水1l；

(5)将上一步所得到的cupriavidusbasilensisb-8种子液在12000rpm条件下离心10分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(6)将收集的cupriavidusbasilensisb-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣b培养基中，于30℃温度下，自然ph，培养3天，过滤分离得湿渣c；其中所述干渣b培养基各成分配比为：干渣b10.0g，k2hpo41.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，mgso40.2g，cacl20.01g，feso4.7h2o0.015g，mnso4.h2o0.01g，蒸馏水1l；

(7)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣c，置于60℃烘干至恒重得到干渣d。

(8)将干渣d按固液比1:40(g/ml)加入50mm柠檬酸缓冲液(ph＝4.8)及纤维素酶12pfu/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到高纯度糖。

经本实施例细菌强化预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量从1.276g/l提高到5.38g/l，酶解效率提高为未处理的4.2倍，较本发明条件下单独氨法预处理提高了约21.7％。

实施例2

(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

(2)进一步将木质纤维素置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为0.5％的氨水溶液，静置于180℃恒温环境中30min后，过滤分离得到湿渣a。

(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣a，直至冲洗液ph呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣b。

(4)将保存在lb固体平板上的cupriavidusbasilensisb-8菌体接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm处的光密度达到0.8-1.0)，得到cupriavidusbasilensisb-8的种子液；其中所述lb固体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15g/l，蒸馏水1l；

(5)将上一步所得到的cupriavidusbasilensisb-8种子液在12000rpm条件下离心10分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(6)将收集的cupriavidusbasilensisb-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣b培养基中，于30℃温度下，自然ph，培养3天，过滤分离得湿渣c；其中所述干渣b培养基各成分配比为：干渣b10.0g，k2hpo41.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，mgso40.2g，cacl20.01g，feso4.7h2o0.015g，mnso4.h2o0.01g，蒸馏水1l；

(7)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣c，置于60℃烘干至恒重得到干渣d。

(8)将干渣d按固液比1:40(g/ml)加入50mm柠檬酸缓冲液(ph＝4.8)及纤维素酶12pfu/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到高纯度糖。

经本实施例细菌强化预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量从1.276g/l提高到6.019g/l，酶解效率提高为未处理的4.7倍，较本发明条件下单独氨法预处理提高了27％。

实施例3

(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

(2)将木质纤维素置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)加入浓度为0.5％的氨水溶液，静置于200℃恒温环境中30min后，过滤分离得到湿渣a。

(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣a，直至冲洗液ph呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣b。

(4)将保存在lb固体平板上的cupriavidusbasilensisb-8菌体接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(600nm处的光密度达到0.8-1.0)，得到cupriavidusbasilensisb-8的种子液；其中所述lb固体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂15g/l，蒸馏水1l；

(5)将上一步所得到的cupriavidusbasilensisb-8种子液在12000rpm条件下离心10分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(6)将收集的cupriavidusbasilensisb-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣b培养基中，于30℃温度下，自然ph，培养3天，过滤分离得湿渣c；其中所述干渣b培养基各成分配比为：干渣b10.0g，k2hpo41.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，mgso40.2g，cacl20.01g，feso4.7h2o0.015g，mnso4.h2o0.01g，蒸馏水1l；

(7)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣c，置于60℃烘干至恒重得到干渣d。

(8)将干渣d按固液比1:40(g/ml)加入50mm柠檬酸缓冲液(ph＝4.8)及纤维素酶12pfu/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到高纯度糖。

经本实施例细菌强化预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量从1.276g/l提高到5.485g/l，酶解效率提高为未处理的4.3倍，较本发明条件下单独氨法预处理提高了约30％。

通过实施例1-3的实施可以发现，细菌作用效果显著，与氨法预处理相比，酶解效果最大可提高约30％；与未处理相比，氨法-细菌联合预处理使酶解效果提高了约4-5倍(如附图1)。此外，组分分析结果(如附图2)表明，细菌作用后木质素的含量进一步降低，说明了本发明的细菌对木质素的降解具有一定的作用。扫描电镜的结果(如附图3)表明，未处理时木质纤维素表面光滑平整，氨法预处理后表面变得凹凸不平，但仍然较为致密。细菌强化预处理后，表面致密的结构被彻底瓦解，形成了高度疏松的表面，可充分使内部的纤维素暴露出来，极大提高了酶解过程中酶的可及表面。

对比例1

对比例1仅用氨处理水稻秸秆，具体条件为氨水浓度5％，反应温度160℃，固液比1:10(g/ml)、反应时间30min时，所得处理渣的酶解效率是未处理的4.6倍，与实施例1中的效果(4.2倍)相差不大。然而，对比例1中的氨水浓度(5％)却是实施例1中(0.5％)的10倍。由此可见，本发明采用的细菌强化氨法预处理可大幅降低氨溶液的浓度，不仅降低了药剂消耗，还解决了高浓度氨法产生的挥发和设备密闭等问题，同时还可达到较好的木质纤维素预处理效果，具有显著的技术优势。

对比例2

本对比例中采用的木质纤维素预处理方法，仅包括本发明细菌cupriavidusbasilensisb-8预处理过程，具体步骤如下：

(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重，得到干渣b；

(2)将保存在lb斜面的cupriavidusbasilensisb-8菌体接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到cupriavidusbasilensisb-8的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(3)将上一步所得到的cupriavidusbasilensisb-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(4)将收集的cupriavidusbasilensisb-8菌体按20％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于水稻秸秆培养基中，于30℃温度下，自然ph，培养3天，过滤分离得湿渣；其中所述水稻秸秆培养基各成分配比为：干渣b10.0g，k2hpo41.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，mgso40.2g，cacl20.01g，feso4.7h2o0.015g，mnso4.h2o0.01g，蒸馏水1l；

(5)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣，置于60℃烘干至恒重得到干渣c。

(6)将干渣c按固液比1:40(g/ml)加入50mm柠檬酸缓冲液(ph＝4.8)及纤维素酶12pfu/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。

经本对比例预处理后的水稻秸秆的还原糖产量约为2.2g/l，略高于未处理水稻秸秆(1.267g/l)，但远远低于实施例中的还原糖产量(5～6g/l)。说明单独采用cupriavidusbasilensisb-8预处理未能达到理想效果。而本发明在氨法预处理的基础上，通过cupriavidusbasilensisb-8的作用产生了意想不到的效果。

对比例3

本对比例中采用的木质纤维素预处理方法与实施例中的过程相同，仅将实施例步骤(6)中的大部分培养基成分改为与专利(申请号：201610569477.0)相同，以本发明实施例制备的干渣b10.0g/l，代替碱木质素1-6g，其他组分为：(nh4)2so40.28g，k2hpo41g，mgso40.2g，cacl20.1g，feso40.05g，mnso40.02g，kh2po41g，蒸馏水1000ml。结果发现，利用专利(申请号：201610569477.0)中的培养基条件后，细菌生物量显著减少，预处理后的水稻秸秆的酶解效果仅约为实施例中的1/2。对比说明本发明经过培养基成分和条件的筛选，得到了适合于本发明废弃生物质预处理的培养基成分和方法。