一种产乳糖酶的嗜冷杆菌菌株及使用该菌株制备低温乳糖酶的方法与流程

本发明涉及一种低温乳糖酶、该酶的产生菌及其制备方法。具体而言，本发明涉及一种由嗜冷杆菌(cryobacteriumsp.)新菌株lw097产生的、在较低的温度下具有较高活性的乳糖酶，及其利用该微生物菌株制备低温乳糖酶的生产方法，属于微生物技术领域。

背景技术：

牛乳等大多数哺乳动物母乳中都含有乳糖。人类食用乳品中的乳糖后，主要由分布于小肠刷状缘细胞膜上的乳糖酶根皮苷水解酶所水解，但亚洲人群由于遗传背景和饮食差异等原因，90％以上的人乳糖酶缺乏，食用乳制品后乳糖不能被消化和吸收，产生腹痛、腹胀、恶心和呕吐等乳糖不耐受的症状(husain2010)。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,ec3.2.1.23)，俗称乳糖酶，能够体外水解乳品中的乳糖，从而有效避免乳糖不耐症患者由于自身乳糖酶缺乏而导致食用乳品产生的不良反应。此外，利用β-半乳糖苷酶水解乳制品中的乳糖，能够同时克服炼乳、奶粉及冰淇淋等乳制品的乳糖析出问题，延长货架期，提高乳制品的甜度。

目前用于分解乳品中乳糖的β-半乳糖苷酶主要来源于公认安全(gras)的克鲁维酵母属(kluyveromycessp.)和曲霉属(aspergillussp.)的菌株(oliveiraetal.2011)，均属于中温乳糖酶。商品名为lactozym的β-半乳糖苷酶，即为来源于乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)的中温β-半乳糖苷酶。该酶最适反应温度为50℃，在低于20℃的低温条件下水解乳糖的效率仅为常温下的10％左右，其酶活还易受到ca2+和na+的抑制(wierzbicka-wosetal.2011)。实际生产若采用常温水解，增大了牛乳腐败变质的风险；而选择低温水解则使生产周期延长、成本增加，严重限制了低乳糖牛乳的产能并推高了生产成本。因此，为开发获得更适合低温条件下低乳糖牛乳生产的β-半乳糖苷酶，各国均试图从各种低温生境的微生物中分离获得酶学特性满足乳品低温加工所需的低温β-半乳糖苷酶。

由于每种微生物所产酶的特性通常存在差异，如酶的作用ph范围和最适酶解ph、酶的作用温度范围与最适作用温度以及酶的热稳定性等，国际上对产低温酶微生物的研究主要聚焦于南北极冰川及深海环境。

以下为目前低温乳糖酶研究的主要菌种及其产生的乳糖酶的特性。

节杆菌属(arthrobactersp.)的d2菌株，其产生的乳糖酶最适作用温度为25℃，在10℃仅可保留40％酶活，50℃处理10分钟基本失去活性(lovelandetal.1994)。

肉杆菌属(carnobacteriumpiscicola)ba菌株，其产生的乳糖酶的最佳作用温度为30℃，稳定性较差，需在添加10％甘油的溶液中保存，40℃处理10min完全失去活力(coombsandbrenchley1999)。

动性球菌属(planococcus)菌株，其产生的乳糖酶最适ph为6.5，最佳作用温度为42℃，55℃处理10min可以完全失去活力(sheridanandbrenchley2000)。

从南极虾体内分离的假交替单胞菌属pseudoalteromonassp.22b菌株，其产生乳糖酶最适温度为6℃，其产生的乳糖酶的最佳作用温度为40℃(ph6.0-8.0)，k+,na+,mn2+,mg2+对该乳糖酶有一定的激活作用，cu2+对该乳糖酶有抑制作用，ca2+对该乳糖酶无明显抑制或激活作用(turkiewiczetal.2003)。

从南极干谷(antarcticdryvalley)土壤分离的节杆菌属(arthrobacter)菌株，其产生的一种乳糖酶最佳作用温度为18℃，0℃保留50％的酶活性，对热敏感，37℃处理10min酶活消失。

黄杆菌属flavobacteriumsp.4214菌株，其产生乳糖酶最适温度为25℃，其产生的乳糖酶的最佳作用温度为42℃，对25℃以上温度较敏感(sorensenetal.2006)。

从节杆菌属的arthrobacterpsychrolactophilusf2菌株，其产生的一种乳糖酶rbglap最佳作用温度为10℃，ph8.0，50℃处理5min失去活性。

从新疆天山一号冰川分离的水生拉恩氏菌(rahnellaaquatilis)菌株14-1，其产生的乳糖酶的最适反应温度为35℃，最适反应ph值为6.5-7.0(刘文玉2008)。

普鲁兰久浩酵母(guehomycespullulans)17-1菌株，其产生的乳糖酶的最佳作用温度为50℃，最佳作用ph为4.0(songetal.2010)。

副球菌属paracoccussp.32d菌株，其产生的乳糖酶的最佳作用温度为40℃，最佳作用ph为7.5(wierzbicka-wosetal.2011)。

海旋菌属的thalassospirasp.3sc-21，其产生的乳糖酶的最佳作用温度为20℃，最佳作用ph6.5，45℃处理失去酶活。

从新疆天山一号冰川分离的拉恩氏菌属rahnellasp.r3菌株，其产生乳糖酶的能力为3.01u/ml，该酶的最适作用温度为25℃，最适ph为7.0，15℃时的酶活为最高酶活的92％，4℃时为31％(沈莲莲2013)。

技术实现要素：

针对目前国内外产低温乳糖酶的菌株性能尚不能满足低温乳糖酶工业化生产技术的要求。本发明的目的在于提供一种低温乳糖酶，产生该酶的微生物菌种及生产该低温乳糖酶的方法。所述的低温乳糖酶能在低温条件下有效水解乳品中的乳糖，在经巴氏灭菌热处理后可灭失其酶活性。

本发明通过对新疆天山冰川沉积层的土壤样本进行微生物菌种的分离、培养和筛选，获得一批耐低温微生物菌株，并从中分离筛选出低温乳糖酶产生菌株，编号为lw097，从而提供了一株低温乳糖酶产生菌，其具有生产低温乳糖酶的优良特性。

同时，本发明还提供了一种低温乳糖酶，通过利用本发明的菌株经过本发明确定的具体发酵工艺而获得。

本发明提供了一种低温乳糖酶菌株，命名为lw097，其能够产生低温乳糖酶。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)。地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，邮编：430072，保藏日期是2017年1月9日，保藏号：cctccm2017015。该菌株培养温度5～20℃，最适培养温度16℃；优先生长于1/4tsb培养基表面(大豆肉汤水解物1.25g，酪蛋白水解物4.25g，氯化钠0.5g，葡萄糖0.75g，磷酸氢二钠0.425g，蒸馏水1000l)，经16℃培养72小时，菌落呈白色透明状，菌落直径1.2mm,依据微生物学鉴定有关方法，对该菌株的16srdna序列进行系统进化分析，确定lw097菌株属于嗜冷杆菌属(cryobacteriumsp.)。嗜冷杆菌新菌株cryobacteriumsp.lw097可产低温乳糖酶，在ph4.0～10.0,5～50℃范围内均有作用，其最适酶解条件为温度25～30℃，ph6.0。本发明进一步建立了菌种保藏、选育的系统工艺流程技术。

本发明的低温乳糖酶产生菌cryobacteriumsp.lw097，其16srdna序列为<210>1。

将lw097的16srdna序列与genebank中的同源序列进行对比及进化分析，lw097的16srdna序列与cryobacteriumarcticumpamc27867的同源性达到99％，与多株cryobacterium属菌株的同源性都达到99％以上，且对其同源序列进行进化分析，cryobacteriumsp.tmn-42(jx949938.2)与lw097分在同一分支，其系统进化关系如图1所示，暂定该菌株为嗜冷杆菌cryobacteriumsp.lw097。

作为本发明低温乳糖酶的产生菌种，既可为本发明所保护的菌株，也可为自然筛选的原始菌株，或为保护菌株通过自然变异或人工诱导变异的变异菌株，通过本发明所述的方法，均可实现本发明所阐述的技术效果。

作为上述变异菌株的研制方法，包括物理诱变，如紫外线辐射处理、钴60辐照处理、离子注入处理、激光辐照处理等各种射线处理；化学诱变，如亚硝基胍(ntg)、硫酸二乙酯等化学诱变剂处理，用常规乳糖酶产生菌分离筛选培养基及方法优化筛选出生产性能优异的菌株。

作为本发明低温乳糖酶的产生菌种，还可以是通过分子生物学技术，从原始菌株或诱导变异菌种中获取该低温乳糖酶基因，所获取的低温乳糖酶基因序列为<210>2；<210>3；<210>4；<210>5中的一种；以原核微生物，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，植物乳杆菌菌、乳酸乳球菌等，以真核微生物，如酿酒酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母等，作为基因受体菌，构建基因工程生产菌株，也可作为本发明的低温乳糖酶产生菌种。

作为本发明的低温乳糖酶产生菌种cryobacteriumsp.lw097，可采用如下方法对其进行保存、活化与筛选，及其摇瓶发酵获得本发明的低温乳糖酶。

本发明的低温乳糖酶产生菌cryobacteriumsp.lw097采用常规的斜面传代保存法，此方法是将本发明菌种接种于只要适合于细菌生长的斜面培养基表面，15～20℃培养3～4天，再于4℃下低温保藏，可存放3个月左右，或是利用真空冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温或常温保藏可达1年以上。

长期保藏的菌种在使用时按如下方法进行活化、筛选。将长期保藏的本发明菌种接种于1/4tsb培养基或其他适合于该细菌生长的培养基表面，15～20℃培养3～4天；本发明优先选用1/4tsb培养基表面(大豆肉汤水解物1.25g，酪蛋白水解物4.25g，氯化钠0.5g，葡萄糖0.75g，磷酸氢二钠0.425g，蒸馏水1000l)。再将培养后的菌种接种于乳糖酶筛选培养基上，其筛选培养基如下：大豆肉汤水解物1.25g，酪蛋白水解物4.25g，氯化钠0.5g，葡萄糖0.75g，磷酸氢二钠0.425g，琼脂15g，蒸馏水1000l，x-gal0.01％，itpg0.1mm，经16℃培养72小时，生成蓝色菌落。产生蓝色菌落意味着菌株可产生乳糖酶。

利用经筛选出的本发明的实验菌株进行发酵培养实验，获得本发明的低温乳糖酶。在发酵培养过程中，可将斜面菌种直接接种于发酵培养基中，或是将菌株先进行液体增殖培养，再以5％～15％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。

作为培养基的营养源，可广泛使用通常用于培养的营养源。只要是可作为碳源同化的碳化合物或者是含有该碳化合物的，微生物菌种可利用的、适合于发酵培养产生发明菌的低温乳糖酶的碳源即可，例如，可使用淀粉、玉米粉、葡萄糖、麦芽汁、蔗糖、水解糖、可用的多糖等。其用量依据其他营养源的选择不同及培养条件的差异而有所不同，本发明中优选乳糖为最优碳源，其用量为4％。

作为氮源，只要是可作为氮源同化的氮化合物或者是含有该氮化合物的即可，例如，可用铵盐、硝酸盐、大豆粉、肉类提取物、玉米浸渍液、玉米浆、酵母膏等。其氮源的选择和用量，可依据其他营养源的成分和用量的不同而不同，只要选适于本发明的低温乳糖酶产生菌的培养及酶的产生即可。本发明中优选胰蛋白胨+酵母浸膏为最佳的氮源，其用量分别为1.5％和0.5％。

作为无机盐类，可适当添加磷酸氢氨、磷酸二氢钾等的磷酸盐、镁盐、钙盐、锰盐等的盐类。培养条件依据培养基的组分多少而不同，但只要是适合于菌体培养产生本发明中的乳糖酶的条件即可。

通常，可选择以下的条件进行培养。即，培养温度为15～20℃，最好为16℃；培养时间约3～4天，只要在本发明的低温乳糖酶的生产量达到最高时结束培养即可；培养基的ph可在6～8的生产范围，特别是在7左右更适合于本发明乳糖酶的生产。经如上所述的培养，主要在菌体细胞内产生目的产物低温乳糖酶。

从如上所得的培养液中采集低温乳糖酶，可按照通常用于采集细胞内酶的方法，如反复冻融、乙酸乙酯处理、超声波破碎、高速匀浆破碎等，进一步由离心、硫酸铵盐析、超滤浓缩、冷冻干燥、色谱分离等，分离精制而进行。

即，可由下述方法获得本发明的低温乳糖酶：由过滤法或离心分离法从发酵液中分离得到菌体，对收集的菌体采用磷酸盐缓冲液进行冲洗和重悬后，通过反复冻融法、超声破碎法或高速匀浆破碎法，使酶从细胞内释放出来，添加可溶性盐类，使酶沉淀的盐析法；添加亲水性的有机溶剂，使酶活夹杂沉淀的有机溶剂沉淀法；使用离子交换树脂等的吸附脱离法；凝胶过滤法；添加稳定辅助剂或不添加稳定辅助剂的喷雾干燥法；单独或多个组合使用冷冻干燥等的分离或精制方法。

通过本发明如上的阐述，得到后面实施例进一步的验证，得知本发明低温乳糖酶的酶学特性。本发明菌株lw097产生的低温乳糖酶最适酶解ph为6.0左右，在ph4～9范围内可保持较高的酶活性；在5～50℃范围内均有酶活性，其最适作用温度在30℃左右；该低温乳糖酶在低温下的稳定性较好，对热较敏感，20℃下保温120min，其酶活仍可保持80％左右；金属离子对低温乳糖酶的活性具有一定的影响作用，其中k+对其酶学活性有一定的激活作用，cu2+、fe2+对其酶学活性有显著的抑制作用，ca2+、zn2+、mn2+、mg2+、na+和fe3+对其酶学活性影响较小。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。

本发明的嗜冷杆菌新菌株cryobacteriumsp.lw097及在微生物分类学上来说与其同等的菌株及其变异菌株，可有效地用于产生本发明的低温乳糖酶。再有，本发明的优点在于，使用所述菌株制造具有上述性质的低温乳糖酶的方法可有效的产生所述的低温乳糖酶。

一种嗜冷杆菌菌株，其特征在于，所述嗜冷杆菌菌株cryobacteriumsp.lw097为以保藏号cctccm2017015保藏于中国典型培养物保藏中心的菌株。

一种低温乳糖酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、菌种活化：对权利要求1中所述的嗜冷杆菌新菌株cryobacteriumsp.lw097进行菌种活化培养；

b、产酶发酵：利用步骤a获得的活化菌种进行产酶发酵培养，即可得到低温乳糖酶。

a步骤中使用培养基a，所述培养基a按照质量体积比配得，乳糖1％～2％，酵母浸膏1％～2％，nacl0.5％～1％，胰蛋白胨0.5％～1％，蒸馏水溶解调整ph至6.8～7.2；活化培养的温度为15～20℃，培养4～5天，制得活化的种子培养液。

将a步骤制得的种子培养液按照5～15％接种量接种于如下发酵培养基b中，培养基b按照质量体积比配得，乳糖1％～4％，胰蛋白胨4％～5％，酵母浸膏1％～2％，硫酸镁0.03％～0.3％，磷酸二氢钾0.003％～0.007％，氯化钙0.009％～0.013％，硫酸锰0.0001％～0.0002％，硫酸亚铁0.002％～0.005％，余量的水，ph为6.5～7.5，灭菌后，在16℃，150～300转/分钟下振荡培养56h～60h，培养后，离心分离收集菌体，～70℃和50℃反复冻融3～5次后，离心分离收集上清获得低温乳糖酶粗酶液，该粗酶液产酶量可达5u/ml。

向所得的低温乳糖酶粗酶液中加入硫酸铵，使其饱和度达到60％以上，静置得到沉淀，将得到的沉淀加入磷酸盐缓冲液中，磷酸盐缓冲液溶解沉淀后，再以透析袋透析脱盐，所得低温乳糖酶的酶活力可达38u/ml。

附图说明

图1所示为基于本发明的嗜冷杆菌新菌株cryobacteriumsp.lw097的16srdna序列的进化分析拓扑结构图。

图2所示为以本发明的嗜冷杆菌新菌株cryobacteriumsp.lw097产生的低温乳糖酶反应ph和相对酶活性关系的图。

图3所示为以本发明的嗜冷杆菌新菌株cryobacteriumsp.lw097产生的低温乳糖酶反应温度和相对酶活性关系的图。

图4所示为以本发明的嗜冷杆菌新菌株cryobacteriumsp.lw097产生的低温乳糖酶在各温度下处理残余酶活性的图。

图5所示为以本发明的嗜冷杆菌新菌株cryobacteriumsp.lw097产生的低温乳糖酶在各反应ph下处理残余酶活性的图。

图6所示为各种金属离子对本发明的嗜冷杆菌新菌株cryobacteriumsp.lw097产生的低温乳糖酶酶活性的影响作用。

图7所示为以邻硝基苯(onp)为标准品，od值与邻硝基苯(onp)含量之间的关系。

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

具体实施方式

实施例1：产低温乳糖酶嗜冷杆菌(cryobacteriumsp.)菌株lw097的培养

将本发明的低温乳糖酶产生菌lw097接种于添加0.01％x～gal，0.1mmiptg的1/4tsb平板培养基中，其中大豆肉汤水解物1.25g，酪蛋白水解物4.25g，氯化钠0.5g，葡萄糖0.75g，磷酸氢二钠0.425g，蒸馏水1000l，1.0kg/cm2蒸汽灭菌15分钟。经16℃培养72小时，则本发明的产低温乳糖酶菌的菌落呈蓝色。

实施例2：产低温乳糖酶嗜冷杆菌(cryobacteriumsp.)菌株lw097的发酵培养

将本发明的产低温乳糖酶嗜冷杆菌(cryobacteriumsp.)菌株lw097接入种子培养基：乳糖10g，酵母浸膏10g，nacl4g，胰蛋白胨5g，蒸馏水1000ml，ph7.0，16℃培养4～5天；然后，以5％接种量接种于如下发酵培养基中。乳糖40g，磷酸二氢钾0.05g，胰蛋白胨15g，氯化钙0.11g，酵母浸膏5g，硫酸锰0.001g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，ph7.0，250ml三角瓶中，每瓶装50ml，1.0kg/cm2蒸汽灭菌15分钟。16℃，200转/分钟下振荡培养56h。培养后，离心分离收集菌体，～70℃和50℃反复冻融后，离心分离收集上清获得低温乳糖酶粗酶液，其产酶量可达6u/ml。向所得的低温乳糖酶液中加入硫酸铵，使其饱和度达到60％，静置沉淀，得到部分沉淀物，再以透析袋透析脱盐，所得低温乳糖酶的酶活力可达38u/ml。

实施例3：低温乳糖酶酶活性的测定方法

采用比色测定法进行低温乳糖酶活力的测定。以邻硝基苯～β～d～半乳糖苷(onpg)为作用底物，以单位体积的单位酶液在单位时间内其酶解产物邻硝基苯酚(onp)的生成量进行酶活力的计算。

酶活定义：在一定的条件下，1min水解onpg生成1μmolonp定义为1个酶活单位。根据标准曲线和420nm测定的od值计算onp含量。在上述条件下，1min水解onpg生成1μmolonp定义为1个酶活单位。具体方法如下：

a：onp标准曲线的绘制：取onp139.0mg(邻硝基酚)标准品放入100ml容量瓶中，加95％乙醇10ml使之溶解，再用ph7.0的磷酸缓冲液定容至1000ml，配制成1mmol·l～1onp母液，分别吸取该溶液2ml、4ml、6ml、8ml、10ml、12ml、14ml，分别加入到100ml的容量瓶中，用ph7.0的磷酸缓冲液定容后混匀，上述稀释液每毫升分别含onp0.02μmol、0.04μmol、0.06μmol、0.08μmol、0.10μmol、0.12μmol、0.14μmol，以ph7.0的磷酸缓冲液为空白，在波长420nm处测吸光度，以吸光度值为纵坐标，以onp浓度为横坐标绘制标准曲线，见图7。

b：乳糖酶活性的测定：在微孔板中，向每孔加入含4mg/ml的50.0μl底物onpg(溶于0.1m磷酸缓冲液，ph7.0)的溶液a和50.0μl粗酶液，15℃下保温15min后，加入200.0μl0.5m预冷碳酸钠终止反应，产物邻硝基苯酚(o～nitrophenyl，onp)在碱性环境下，显黄色，于420nm波长处测定吸光值。测定酶活时，粗酶液用0.1m磷酸缓冲液适量稀释，使od420值在0～0.8的线性范围内)

c：酶活力的计算按如下公式：

e：酶活力值(u/ml)；od420：420nm波长处测定的吸光值；n：粗酶液稀释倍数；t：粗酶液与底物反应的时间。

实施例4：作用ph对低温乳糖酶酶活力的影响

作用ph和最佳ph测定，以onpg为底物，按前述的低温乳糖酶活性测试方法进行测定。测定的ph分别为3～10范围内的不同ph值条件下的酶活力e。以测定酶活力最高的ph下酶活值为对照，设定其相对酶活力100％，则作用ph与酶活性的关系如图2所示。本发明菌株lw097产生的低温乳糖酶在30℃下其最适酶解ph为6.0，在ph6～8范围内可保持较高的酶活性。

实施例5：作用温度对低温乳糖酶酶活力的影响

作用ph和最佳ph测定，以onpg为底物，按前述的低温乳糖酶活性测试方法进行测定。测定温度范围为5℃～60℃的不同温度。以测定酶活力最高的温度下的酶活值为对照，设定其相对酶活力100％，则作用温度与酶活性的关系如图3所示。在5℃～60℃的温度范围内，本发明菌株lw097产生的低温乳糖酶均呈现酶活性，其最佳酶解温度为30℃左右。在10～30℃的测定温度范围内具有良好的酶学特性，在20℃下可保持70％左右的相对酶活力、10℃下仍可保持60％以上的相对酶活力。

实施例6：低温乳糖酶的热稳定性

将实施例2得到的低温乳糖酶液在30℃、ph6.0条件下保温，然后按实施例3所述酶活性测定方法每隔20分钟对其残余酶活力进行测定。以未进行保温处理的酶活力值未对照，设定其相对酶活力为100％，则此时的处理温度和残余活性的关系如图4所示。本发明菌株lw097所产生的低温乳糖酶在30℃以下具有较好的热稳定性，30℃保温120分钟仍可保持60％左右的相对酶活力，具有较高的热稳定性。

实施例7：低温乳糖酶的ph稳定性

将实施例2所得的低温乳糖酶粗酶液按1：1的比例分别与ph2～11的缓冲液混合，在4℃下保温12h，然后将酶液调回到最适作用ph值(ph6.0)，在30℃下测定残余酶活。以ph6.0下的酶活力测定值为对照，设定其相对酶活力为100％，此时的处理ph和残余活性的关系如图5所示。本发明菌株lw097所产生的低温乳糖酶在ph6.0～ph8.0的范围内保持稳定。

实施例8：金属离子对低温乳糖酶酶活力的影响作用

金属离子对低温乳糖酶的影响作用按上述酶活性测定法，在ph6.0的磷酸盐缓冲液中添加ca2+、zn2+、cu2+、mn2+、mg2+、na+、k+、fe2+和fe3+，使其终浓度达到10mm。按实施例3所述酶活性测定方法进行测定。以未加入金属离子的为对照，设定其相对酶活力为100％，则金属离子对酶活力的影响作用如图6所示。其中k+对其酶学活性有一定的激活作用，cu2+、fe2+对其酶学活性有显著的抑制作用，ca2+、zn2+、mn2+、mg2+、na+和fe3+对其酶学活性影响较小。

实施例9：一种低温乳糖酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、菌种活化：对权利要求1中所述的嗜冷杆菌新菌株cryobacteriumsp.lw097进行菌种活化培养，得到种子培养液；

b、产酶发酵：利用步骤a获得的活化菌种进行产酶发酵培养，即可得到低温乳糖酶。

a步骤中使用培养基a，所述培养基a按照质量体积比配得，乳糖1％～2％，酵母浸膏1％～2％，nacl0.5％～1％，胰蛋白胨0.5％～1％，蒸馏水溶解调整ph至6.8～7.2；活化培养的温度为15～20℃，培养4～5天，制得活化的种子培养液。

将a步骤制得的种子培养液按照5～15％接种量接种于如下发酵培养基b中，培养基b按照质量体积比配得，乳糖1％～4％，胰蛋白胨4％～5％，酵母浸膏1％～2％，硫酸镁0.03％～0.3％，磷酸二氢钾0.003％～0.007％，氯化钙0.009％～0.013％，硫酸锰0.0001％～0.0002％，硫酸亚铁0.002％～0.005％，余量的水，ph为6.5～7.5，灭菌后，在16℃，150～300转/分钟下振荡培养56h～60h，培养后，离心分离收集菌体，～70℃和50℃反复冻融3～5次后，离心分离收集上清获得低温乳糖酶粗酶液，该粗酶液产酶量可达5u/ml。

向所得的低温乳糖酶粗酶液中加入硫酸铵，使其饱和度达到60％以上，静置得到沉淀，将得到的沉淀加入ph7.2～7.4的pbs磷酸盐缓冲液中，磷酸盐缓冲液溶解沉淀后，再以透析袋透析脱盐，所得低温乳糖酶的酶活力可达38u/ml。

<110>石河子大学

<120>一种产乳糖酶的嗜冷杆菌菌株及使用该菌株制备低温乳糖酶的方法

<141>

<160>5

<210>1

<211>1487

<212>核苷酸序列

<213>嗜冷杆菌（cryobacteriumsp.lw097）

<220>

<221>misc_feature

<223>16srrna基因核苷酸序列

<400>1

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<210>2

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<220>

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<223>b-gal322乳糖酶基因核苷酸序列

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<212>核苷酸序列

<213>b-gal435乳糖酶基因

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<221>misc_feature

<223>b-gal435乳糖酶基因核苷酸序列

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atgagcgccgtgagcacggtctcgaccaacgagcatcgctgggtgcgctggcccgaggcgcacaccctcgccgacggcaccgagagcctgcccgccgacgccgcccgcatcggctacggcgccgactacaaccccgaacagtggcccgaagaggtctgggccgaagacatgcgcctgatgcgcgaggccggtgtcaacatcgtcagcgtcggcatcttctcctgggcgctgctgcagcccaccccggacagctgggatttcggttggctcgaccgcgccatcgatctgctgcacgccaacggcatcgccgtcgacctggccaccgccaccgccagcccgccgccgtggctcaccgagctgcacccggaggtgctgccggtgaaccgggtcggcgaaaccatctggcccggcggccgccagcagtggcgccccacctcaccggtgttccgccgctacgcgctggccctggtcgagaaaatggccgagcgctacgccaaccacccggccctgtcgatgtggcacatcagcaacgagctcggctgccacaacgtctacgacttctcggacgacgcggcagcggcgttccgcgcctggctcgaggcccgctacggcactctcaccgaactcaaccgggcctggggcaccgccttctggtcgcagaactacacctcctggaaccagatcctgccgccgcggctggccgcgacgcatccgaaccccacccagcagctcgacttcgcccggttctcgagcgacgccctcaagggctacctcgtcgccgagcgggagatcctgcgccagatcacgcccgacgtgccgatcaccaccaacttcatggtgatgggcgagtcccgcggcatggactacgccgactgggccggcgagatcgacctggtctccaacgaccactacctgctcgtggccgaccccgccgcgttcgaggagctgtcgttctcggccaacctcaccggccagatatccggccgggcgccgtggttcctgatggagcactccaccagcgccgtcaactggcagccggtgaaccaggccaaaacccccggccagctgcgccgggacagcctcacccacctggcccacggcgccgacgcgatctgcttcttccagtggcgccagtccttggccggcgccgagaagttccactccgcgatgctcccgcacgcgggggagaacagctcggtgttccgcagcgtcacccgcttcggcggcgaactcgcttccctggcagaggtcgccggcagccgcaccaagcaggcccgcatcggaatcctcttcgactgggactcctggtgggcctccgaactcgactcgcaccccaccgagctgctgcgctacaaggccgaggccatggcctggtacaccgccgcgctcaccattggcctgcaggccgacattgtgccggcccggtcggtgctgaacggtcacggcctcgccgggtacgacctcgtcatcgcgccgatgctctacatagtgccgcagccgctggcggatgccctggccgactacgcccgcaccggcggccacctggtggtcggcgtgttctccggcattgccgacgccgacgaccacatccaccccggcggttaccccggcgcgttccgcgagctgctcggcgtgcgcgccgaggagttcggcggcctgcagccgggccagaccgtcggcctgtccggcgacctgccggccgggtcaaccgggtcgctgctcacccacgacgtcaccgtggcctccgatgtccaggtgctcgcccgcttccaggacggcccgttccccggtgtgccggcggtgaccagccgcgtggtctcgaccgagtccggcggccgggccagcttcgtcgccacggtcctcgaccccgacgcgttggtggctttggtcggccggttcgccgccgccgcccacatcgtctcgccgctgccgagagacgcgcacggcatcgtgcagctcgccgtgcgccagtccgacgacatggactatctcttctacatcaaccactccgacaaggccgtgaccgtgccgctgggcaaggccgatggcacgctcgtggccgtcgacctcggcggcagcaccctcgccgcggactcgctcaccctcccggccaccggcgtcgccgtgctcggccgcgcccgaacggcggcctga

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<212>核苷酸序列

<213>b-gal2567乳糖酶基因

<220>

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<223>b-gal2567乳糖酶基因核苷酸序列

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<210>5

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<212>核苷酸序列

<213>b-gal436乳糖酶基因

<220>

<221>misc_feature

<223>b-gal436乳糖酶基因核苷酸序列

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