NUMB在绝经后妇女原发性骨质疏松症诊断或预后中的用途的制作方法

本发明涉及绝经后妇女原发性骨质疏松症诊断、预测预后领域，更具体地，本发明涉及以检测numb异常为手段的绝经后妇女原发性骨质疏松症诊断、预测预后方法。

背景技术：

骨质疏松症(osteoporosis，op)是一种以骨量低下、骨微结构破坏、导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病(who)。2001年美国国立卫生研究院(nih)提出骨质疏松症是以骨强度下降、骨折风险性增加为特征的骨骼系统疾病，骨强度反映了骨骼的两个主要方面，即骨矿密度和骨质量。

该病可发生于不同性别和任何年龄，但多见于绝经后妇女和老年男性。骨质疏松症分为原发性和继发性两大类。原发性骨质疏松症又分为绝经后骨质疏松症(i型)、老年性骨质疏松症(ii型)和特发性骨质疏松(包括青少年型)3种。绝经后骨质疏松症一般发生在妇女绝经后5-10年内，因绝经后卵巢合成雌激素减少所致，为骨量减少和骨组织微结构破坏，以致骨骼脆性增高从而易发生骨骼的一种全身性疾病。女性绝经后骨密度(bonemineraldensity，bmd)丢失速度很快，年丢失率为1.5％-2.5％，从而导致骨密度急剧下降，使得绝经后女性成为骨质疏松症的高发人群。

具有以下高危因素者易患绝经后骨质疏松症：

雌激素缺乏：雌激素缺乏，被认为是引起绝经后骨质疏松症的主要因素，绝经后卵巢功能减退，分泌雌激素水平降低，同时伴有维生素d、钙的摄入不足，造成继发性骨丢失。

遗传因素：骨质疏松症多见于白种人，其次是黄种人，而黑种人最少。骨密度为诊断骨质疏松症的主要指标，骨密度值主要决定于遗传因素，其次是受环境因素的影响。

营养因素：钙缺乏，已发现青幼年时钙的摄入量与成年人的骨量峰直接有关。低钙饮食(<10mg·kg^-1·d^-1)者有3/4患有骨质疏松，而高钙饮食(10mg·kg^-1·d^-1)者有1/4患有骨质疏松；长期蛋白质营养缺乏，造成血浆蛋白降低，骨基质合成不足，新骨生成落后，如同是伴有钙的缺乏，骨质疏松会加快出现；维生素c缺乏，是骨基质羟脯氨酸合成不可缺少的，如缺乏可使骨基质合成减少。

废用因素：肌肉对骨组织是一种机械力的影响，肌肉发达则骨骼粗壮，骨密度高。老年人活动减少，肌肉强度减弱，机械刺激减少，骨量减少。同时肌肉强度的减弱和协调障碍是老年人较容易摔倒，伴骨量减少时，则已发生骨折。

其他因素：酗酒、嗜烟、过多咖啡和咖啡因的摄入、肝素使用均是本病的危险因素。酒精中毒可影响钙的吸收，酒精也直接作用于成骨细胞，抑制骨的形成。咖啡因摄入过多是尿钙和内源性粪钙丢失：肝素可引起骨质疏松，一般研究表明每天接受1500u以上的肝素治疗患者中60％的发展成为骨质疏松症。

此外，年龄增长、服用皮质类固醇和抗惊厥药物、具有骨质疏松症家族史或具有影响骨量的特殊基因、早绝经或绝经前行双侧卵巢切除术也是绝经后骨质疏松症的高危因素。

绝经后骨质疏松症早期可以没有任何症状，骨质在不知不觉中流失，直到发生骨折后才被意识到，亦被称之为“无声杀手”，由于早期没有典型的临床症状，所以常常不能引起医患足够的重视，以致许多患者只能无奈的面对从病痛到恢复的漫漫长路。

诊断骨质疏松症，首先必须进行骨密度的测定。骨密度实际上就是表示骨的健康程度，或是反过来说表示骨的老化程度。常用的检测手段：

x线摄片法：使用历史最早，但由于有放射性，其测验结果不能量化，已逐渐被取代。

单光子测定仪：费用低、方便、辐射量小而安全。但因不能测躯干骨以及不能区别皮质骨、松质骨、软组织等而受限制，已逐渐被取代。

定量超声法：低廉、方便、又无放射性损伤。适合各年龄段人群的骨状态普查工作。不仅能检测骨密度，还能了解骨的质量即可反应骨的微结构及弹性。但目前只用于跟骨、胫骨和指骨，不能进行全身骨骼的检测。

双能x线吸收法：是目前最理想的测定法，是诊断骨质疏松症的金标准，国内外通用，可测全身各部位骨骼，也能测软组织厚度，但该设备数量较少且价格昂贵，因此对于骨质疏松症患者的诊断来说经济负担大。为此寻找一种敏感性高、准确度高且价格合理的诊断骨质疏松症的方法是亟待解决的问题。

近年来，遗传因素已经成为了骨生物学中最活跃的研究领域之一，很多基因已经被确定为调节古骨密度的候选基因。这些候选基因大多数都是影响骨代谢的基因。如维生素d受体(vdr)、脂蛋白受体相关基因5(lrp5)、i型胶原蛋白(colia1)、雌激素受体α、转化生长因子tgfβ1、骨形态发生蛋白(bmps)、runx2、osterix(osx)、sclerostin、tcirg1、igf-1、il-1(骨质疏松症，张弛，中国骨质疏松杂志，2010年10月，802-813)。此外，已经有相当数量的专利申请涉及骨质疏松症的基因诊断，如申请号为：201610272604.0、201610922798.4、201510628024.6、201510628081.4、201510725408.x、201510628042.4、201610530383.2、201510629348.1、201510627056.4、201510627060.0、201610555353.7的专利。可见利用基因来诊断骨质疏松症成为了今后骨质疏松症早期诊断的发展趋势。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种通过检测numb基因或蛋白表达差异来诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的方法。

本发明的目的之二在于提供一种通过检测numb基因或蛋白表达差异来预测绝经后妇女原发性骨质疏松症预后的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测numb基因或numb蛋白的产品在制备绝经后妇女原发性骨质疏松症诊断工具中的用途。

本发明还提供了检测numb基因或numb蛋白的产品在制备预测绝经后妇女原发性骨质疏松症预后工具中的用途。

进一步，所述检测numb基因或numb蛋白的产品包括检测numb基因或numb蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合numb基因的核酸或者能够结合numb蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测numb基因的表达水平；所述物质能够检测numb蛋白的表达水平。

本发明的检测numb基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如pcr、如southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

进一步，所述pcr方法为已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，扩增不应突变系统)法、rt-pcr(逆转录酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特异性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可扩增片段长度多态性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(单链构象多态性)法来检测。

上面所述的核酸包括扩增numb基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

在本发明的具体实施方案中，所述核酸为qpcr实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的检测numb蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫测定法、免疫组织化学法、western印迹等。

本发明的检测numb蛋白的产品包括特异性结合numb蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、单链fv(scfv)、二硫化物键合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v区(双抗体)、或含有cdr的肽。本发明的检测numb蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的numb蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对numb蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用dmso、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-nh2、生物素标记试剂盒-sh(dojindolaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-nh2、碱性磷酸酶标记试剂盒-sh(dojindolaboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-nh2、过氧化物酶标记试剂盒-nh2(dojindolaboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-nh2、藻胆蛋白标记试剂盒-sh、b-藻红蛋白标记试剂盒-nh2，b-藻红蛋白标记试剂盒-sh、r-藻红蛋白标记试剂盒-nh2、r-藻红蛋白标记试剂盒sh(dojindolaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-nh2、hilytefluor(tm)555标记试剂盒-nh2、hilytefluor(tm)647标记试剂盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗体标记试剂盒、qdot(tm)抗体标记试剂盒(invitrogencorporation)和ez-标记物蛋白质标记试剂盒(funakoshicorporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中numb基因或numb蛋白的水平降低的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。

进一步，所述检测numb基因或numb蛋白的产品可以是检测numb基因或numb蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

利用前面所述的检测产品检测绝经女性受试者样本中的numb基因或numb蛋白的表达水平，与正常绝经女性相比，绝经女性受试者样本中的numb基因或numb蛋白的表达水平降低，则诊断该受试者为绝经后妇女原发性骨质疏松症患者或该受试者的预后差。

作为依照本发明的检测产品的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

在本发明的具体实施方案中，所述样本来自绝经女性受试者的血液。

本发明还提供了一种诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的工具，所述工具能够检测绝经女性受试者样本中numb基因或numb蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合numb基因的核酸或者能够结合numb蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测numb基因的表达水平；所述物质能够检测numb蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知numb基因的异常与绝经后妇女原发性骨质疏松症相关也属于numb基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种预测绝经后妇女原发性骨质疏松症预后的工具，所述工具能够检测受试者样本中numb基因或numb蛋白的表达水平，所述预测绝经后妇女原发性骨质疏松症预后工具包括能够结合numb基因的核酸或者能够结合numb蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测numb基因的mrna水平；所述物质能够检测numb蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述预测绝经后妇女原发性骨质疏松症预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨质疏松症的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知numb基因的异常与绝经后妇女原发性骨质疏松症相关也属于numb基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗numb抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合numb即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制numb功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是igg、igm、iga、ige、igd或igy。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗numb抗体的其他性质同前面所述。

进一步，所述受试者样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。

本发明还提供了一种诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症或预测绝经后妇女原发性骨质疏松症预后的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取绝经女性受试者的样品；

(2)检测受试者样品中numb基因或蛋白的表达水平；

(3)将测得的numb基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与正常绝经女性相比，numb基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为绝经后妇女原发性骨质疏松症，或判断患有绝经后妇女原发性骨质疏松症的受试者预后差。

在本发明的上下文中，“诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症”既包括判断绝经女性受试者是否已经患有绝经后妇女原发性骨质疏松症、也包括判断绝经女性受试者是否存在患有绝经后妇女原发性骨质疏松症的风险。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症以及判预测患有预后的分子标志物，使用该分子标志物可以在绝经后妇女原发性骨质疏松症发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方案策略。

附图说明

图1显示利用qpcr检测numb基因在绝经后妇女原发性骨质疏松症患者和正常绝经女性中的表达差异。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选绝经后妇女原发性骨质疏松症患者和正常绝经女性中差异表达的基因

1、研究对象：

选择绝经后妇女原发性骨质疏松症患者3例，年龄分别为81岁、68岁、79岁；正常绝经女性2例，年龄分别为67岁、68岁。

绝经后妇女原发性骨质疏松症患者的纳入标准：绝经超过12个月的汉族绝经后妇女，患者均知情同意；

绝经后妇女原发性骨质疏松症患者的排除标准包括①既往接受过抗骨吸收药物(包括降钙素、双磷酸盐、雌激素等)或促骨形成药物(如甲状旁腺素等)治疗者(单纯使用钙剂和/或维生素d者除外)；②长期服用糖皮质激素者；③合并有恶性肿瘤、骨转移肿瘤和其他内分泌、骨代谢病史(如类风湿性关节炎、甲亢、肾上腺疾病等)者；④脊柱或髋部等部位新鲜骨折或髋关节手术置换者；⑤严重肝肾疾病、长期卧床≧3个月者；⑥精神障碍、认知障碍。

2、血液总rna提取

使用博凌科为tripurelsreagent血液(血液样本)rna抽提试剂进行血液总rna的提取。

基本步骤：

(1)按照3:1的体积比例加入tripurelsreagent和血液振荡混匀；

(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层；

(3)异丙醇沉淀rna；

(4)漂洗rna沉淀；

(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。

3、rna样品的质量分析

利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。

5、片段化rna

illumina平台是针对短序列片段进行测序，mrna平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将rna随机断裂成200bp左右的小片段。

6、反转合成cdna

在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mrna为模板反转合成一链cdna，进行二链合成时，dntps试剂中用dutp代替dttp，使cdna第二链中碱基包含a/u/c/g。

7、连接adaptor

双链的cdna结构为粘性末端，加入endrepairmix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个a碱基，用于连接y字形的接头。

8、ung酶消化cdna二链

在pcr扩增前，用ung酶将cdna第二链消化，从而使文库中仅包含cdna第一链。

9、illuminax-ten上机测序

illuminax-ten测序平台，进行2*150bp测序。

10、生物信息学分析

测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：

(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads；

(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为grch38.p7，fasta和gff文件下载自ncbi；

(3)cuffquant定量mrna的表达量并标准化输出；

(4)在r环境下用degseq包比较对照组跟疾病组mrna的表达差异。显著差异mrna筛选条件：p-value<0.05。

11、结果

用以上标准筛选得到差异表达基因3296个，其中表达上调的基因1428个，表达下调的基因有1868个。

实施例2qpcr实验验证绝经后妇女原发性骨质疏松症患者和正常绝经女性中差异表达的基因

选择实施例1筛选出的numb基因进行大样本验证。

1、研究对象：

选择绝经后妇女原发性骨质疏松症患者30例，正常绝经女性30例，年龄在65-82岁之间。

绝经后妇女原发性骨质疏松症患者的纳入标准：绝经超过12个月的汉族绝经后妇女，患者均知情同意；

绝经后妇女原发性骨质疏松症患者的排除标准包括①既往接受过抗骨吸收药物(包括降钙素、双磷酸盐、雌激素等)或促骨形成药物(如甲状旁腺素等)治疗者(单纯使用钙剂和/或维生素d者除外)；②长期服用糖皮质激素者；③合并有恶性肿瘤、骨转移肿瘤和其他内分泌、骨代谢病史(如类风湿性关节炎、甲亢、肾上腺疾病等)者；④脊柱或髋部等部位新鲜骨折或髋关节手术置换者；⑤严重肝肾疾病、长期卧床≧3个月者；⑥精神障碍、认知障碍。

2、血液总rna提取

使用博凌科为tripurelsreagent血液(血液样本)rna抽提试剂进行血液总rna的提取。

基本步骤：

(1)按照3:1的体积比例加入tripurelsreagent和血液振荡混匀；

(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层；

(3)异丙醇沉淀rna；

(4)漂洗rna沉淀；

(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。

3、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

4、qpcr

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl。

引物序列如下：

扩增numb基因的正向引物序列为5’-acaacagccactgaacaa-3’(seqidno.1)，反向引物序列为5’-atgaaccaacgactatcttatct-3’(seqidno.2)；

扩增gapdh基因的正向引物序列为5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3)，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。

扩增程序：95℃10min，(95℃5s，60℃60s)*40个循环。以sybr

green作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

5、结果

结果如图1所示，与正常绝经女性相比，绝经后妇女原发性骨质疏松症患者血液中numb基因的mrna水平显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05)，结果同rna-seq实验。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

sequencelisting

<110>首都医科大学附属北京友谊医院

<120>numb在绝经后妇女原发性骨质疏松症诊断或预后中的用途

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