本发明涉及法医学领域，具体涉及一种硅藻rbcl基因的分析方法及其在法医检测中的应用。
背景技术：
：：在法医学检案实践中，时常遇到溺死相关案件的检验鉴定。由于我国江河湖海众多，环境复杂，以及尸体腐败等因素影响，水中尸体的死因鉴定一直是法医学实践中的难点之一。对于如何判断水中尸体是生前入水或死后抛尸入水，学界仍存在争议。硅藻检验一直是法医学实践中最常用的方法。目前硅藻检验的方法有很多，但国内常用的硅藻检验法主要基于硅藻形态学进行检测。然而随着分子生物学技术的发展，已有学者尝试通过pcr检测硅藻特异性的dna条形码进行溺死的死因鉴定。dna条形码是指利用短的标准dna序列的核苷酸多样性进行物种的鉴定，利用dna条形码进行硅藻检验可以避免形态学难以区分的藻类，消除人工观察和计数的实验误差。与传统的硅藻形态学检验方法相比，pcr扩增技术检测硅藻dna条形码用于溺死鉴定主要有以下优点：①检测特异性强，可用于不能用显微镜进行形态辨别的硅藻检验；②灵敏度高，所需样本量明显小于传统硅藻检验法；③可用于推断溺死地点和时间。利用硅藻dna条形码的特异性，可以在定性的同时揭示群落特征，如进一步建立不同水域和同一水域不同时间硅藻生物群落特征变化监控系统，并与传统硅藻检验法相结合，对溺死鉴定则有更重要的实用价值。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术中的缺陷和不足，提供了一种对硅藻rbcl基因（largesubunitofribulose-1，5-bisphosphatecarboxylaseoxygenase,rbcl）通用质体扩增区的分析方法，以及利用对硅藻rbcl基因的分析方法在法医检测中的应用，具体是在判断溺亡者真实死因上的应用。叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基基因(largesubunitofribulose-1,5-bisphosphatecarboxylaseoxygenase,rbcl),是叶绿体进行光合作用的关键基因片段，长度约1400bp，在genbank中，rbcl序列的信息比较齐全，出现内含子的概率较小，被广泛用于植物和藻类的分类研究。硅藻是一种广泛分布于水中的单细胞生物，细胞壁由大量硅物质组成，硅藻的种内繁多，形态各异，每一处水源的硅藻组成都不尽相同。因此，通过检测水中尸体各主要脏器内硅藻的存在不仅可成为判断是否生前溺死的重要证据之一，亦可对判断死亡地点具有重要意义。目前利用硅藻检验判定溺死的标准是肺脏，肝脏，肾脏等组织内发现硅藻，且硅藻种类与现场水样一致即可诊断为溺死。本发明所要达到的技术效果通过以下方案实现：本发明中提供一种硅藻rbcl基因在判断溺亡者是否真正死于溺亡的应用。本发明中提供一对检测硅藻rbcl基因的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如seqidno.1所示，下游引物的序列如seqidno.2所示。本发明中还提供一种硅藻rbcl基因分析方法：提取硅藻内核酸，利用上述引物对对硅藻核酸中rbcl基因进行pcr扩增，利用扩增产物制备待测样本，对待测样本进行核酸分析。进一步地，上游引物5’端均以fam荧光标记，能实现在毛细管电泳仪中的荧光检测。本发明中还提供一种硅藻rbcl基因的分析方法，具体为：pcr反应体系为20ml：10μltaq酶；上下游引物各0.75μl，浓度为10μmol/l；7.5μl超纯水；1μldna模板。对于特异性验证试验，dna模板指的是硅藻的基因组dna，对于案件检测实验，dna模板指的是检材基因组dna。这两者的基因组dna皆含有硅藻rbcl基因。进一步地，pcr热循环参数为：94℃10min；94℃40s，50℃1min，72℃1min，共35个循环，最后72℃，延伸7min，将温度降至4℃保存待使用，即得pcr扩增核酸样本。进一步地，所述pcr扩增核酸的检测方法为毛细管电泳检测，检测方法为：将样本核酸pcr扩增产物、甲酰胺、ilscc500混合，其中样本核酸pcr扩增产物、甲酰胺、ilscc500的体积比为1:9:1。本发明中还提供一种上述硅藻rbcl基因分析方法在法医检测过程中的应用，具体是应用于判断溺亡者是否真正死于溺亡。进一步地，所述的应用方法为：取溺水者脏器组织，提取该脏器组织中的核酸，使用本发明中的引物对进行pcr扩增，对其进行检测分析，确认pcr扩增产物是否来源于硅藻rbcl基因，根据硅藻rbcl基因的检出率判断溺亡者是否真正为溺亡。本发明还提供一种判断溺亡者是否真正死于溺亡和/或找出真正溺亡区域的方法，具体为：取溺水者脏器组织，检测脏器组织中是否含有硅藻rbcl基因，根据检测结果判断溺亡者是否真正死于溺亡，以及找出真正的溺亡区域。本发明具有以下优点：1、本发明提出了硅藻rbcl基因在判断溺亡者是否真正死于溺亡的应用。2、本发明中提供了一种对硅藻rbcl基因的分析方法，提供了分析该基因序列的上游引物及下游引物，并同时提供了与硅藻rbcl基因相适配的扩增方法及具体的扩增参数，并将该方法引用到利用硅藻rbcl基因判断溺亡者真正死因的应用中。3、本发明还提供了将上述硅藻rbcl基因分析方法应用于法医检测中的应用，在溺亡者脏器中提取硅藻核酸并用pcr技术进行扩增，然后进行检测并与水样中的硅藻核酸进行比对，通过检出率和硅藻upa基因测序结果的比对，即可判断溺亡者是否真正死于溺亡，同时有助于找出真正的溺亡区域。附图说明图1为本发明中引物的primer-blast结果图；图2为本发明中pcr-ce法检测硅藻标准株变异直链藻rbcl基因的毛细管电泳检测结果图；图3为本发明中引物扩增硅藻标准株扩增产物的ncbi-blast结果图；图4为本发明中检测脏器扩增产物测序图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。实施例1引物设计根据硅藻的rbcl基因设计出一对上下游引物：上游引物（如seqidno.1所示）：5’-ctcaaccattcatgcg-3’下游引物（如seqidno.2所示）：5’-ctgtgtaacccataac-3’实施例2引物对的特异性验证利用实施例1中的引物对分别对采集的29中标准株和人体组织中提取的dna进行扩增，并且做引物特异性的验证，结果如下表1。表1rbcl引物扩增浮游生物标准株、人组织dna的毛细管电泳检测结果table1capillaryelectrophoresistestresults注：+为阳性，—为阴性；s1,s2为不同人体组织提取样本从表中结果可看出，引物rbcl只扩增硅藻（菱形藻，舟形藻，小环藻，变异直链藻，针杆藻，骨条藻）,对上表中蓝藻，绿藻，细菌和人体组织扩增为阴性结果，变异直链藻的毛细管电泳检测图谱见附图2。对扩增产物进行测序，将测序所得序列在ncbi（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）进行blast比对，比对结果（如附图3所示）显示为硅藻。即可证明上述引物可对硅藻进行特异性扩增。实施例3动物组对照实验人为溺死实验猪组（n=15）、实验猪机械处死后入水组（n=15）和非溺死实验猪的空白对照组（n=5）肺脏、肝脏、肾脏（体循环脏器）的检材中提取的基因组dna在相同扩增体系下经本实施例1设计的引物探针进行pcr扩增，对扩增产物进行毛细管电泳分析，规定电泳出现预期的扩增产物片段（201bp），则结果判定为检出，检出率结果见表2。表2硅藻rbcl基因在各组实验动物体循环脏器检出例数及阳性率由上述实验结果可看出，利用本发明中的方法，对实验猪脏器中的dna进行扩增，利用阳性扩增结果来确认实验猪死因的方法检出率可达93%，考虑到溺亡过程中吸入水的不同及个体差异，可认定本发明中的方法可有效判定实验猪是否真正为溺死，同时可协助判断溺亡地点。实施例4硅藻rbcl基因分析方法及在法医检测中的应用利用实施例1设计的引物对可以设计一种硅藻rbcl基因分析方法，本实施例中将本发明中的硅藻rbcl基因分析方法应用于法医检测中，具体应用于确认溺水者是否为溺亡以及寻找溺对应的溺亡区域。本实施例中采用的溺水者确认为真实溺水死亡人员。法医检测步骤为如下：步骤一：在通风橱中剪取溺水者肺脏、肝脏、肾脏组织；步骤二：提取肺脏、肝脏、肾脏组织中的基因组dna；步骤三：使用实施例1中的引物进行pcr扩增；在步骤三中，扩增过程中使用的上游引物为5’-ctcaaccattcatgcg-3’；下游引物为5’-ctgtgtaacccataac-3’。上游引物5’端均以fam荧光标记，能实现在毛细管电泳仪中的荧光检测。实施例中使用的毛细管电泳仪型号为abi-3130xl。pcr反应体系为20ml：10μltaq酶；上下游引物各0.75μl，浓度为10μmol/l；7.5μl超纯水；1μldna模板。先混合扩增原料，dna模板最后加入扩增体系，本实施例中dna模板指的是检材基因组dna。pcr热循环参数为：94℃10min；94℃40s，50℃1min，72℃1min，共35个循环，最后72℃，延伸7min，将温度降至4℃保存待使用，即得pcr扩增核酸样本。步骤四：将pcr扩增得到的核酸进行毛细管电泳检测，检测方法为将样本核酸pcr扩增产物、甲酰胺、ilscc500混合，其中样本核酸pcr扩增产物、甲酰胺、ilscc500的体积比为1:9:1。利用pcr-ce法检测水中尸体脏器的硅藻rbcl基因，具有阳性扩增即可确认为该样本中含有硅藻，该样本可判定为溺水死亡，结果表明与已知死因相符。pcr扩增产物测序如附图4所示。pcr扩增产物测序为：acctactacagcacattgctttagcatactcagcacgtttgtatacttcttccatagtagcagctgtgatgtttaagtatgaacctttaacttcaccggttgcagcggatgcacggttaataccttctaaacaatttaagaaacgttctctccaacgcataaagaattgaga。最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明实施例的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明实施例的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>广州市刑事科学技术研究所<120>一种硅藻rbcl基因分析方法及其在法医检测中的应用<130><160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>16<212>dna<213>引物β-actinf1<400>1ctcaaccattcatgcg16<210>2<211>16<212>dna<213>引物β-actinr1<400>2ctgtgtaacccataac16当前第1页12当前第1页12