一种中性三七多糖的提取纯化方法及促进细胞增殖药理活性研究与应用与流程

本发明属于医药领域，涉及一种中性三七多糖的提取纯化方法及促进细胞增殖药理活性研究与应用。

背景技术：

多糖广泛存在于动物、植物和微生物中。作为生命物质的组成成分之一，它广泛参与了细胞的各种生命现象及生理过程的调节，如免疫细胞间信息的传递与感受，细胞的转化、分裂及再生等活动。20世纪80年代以来，科学家们对中药多糖的研究产生了浓厚的兴趣。到目前为止报道的多糖有100多种，包括人参多糖、香菇多糖、灵芝多糖、黄芪多糖、茯苓多糖、虫草多糖、银耳多糖、刺五加多糖等，具有抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、降血糖、保肝、调节免疫等生理活性，且副作用小

三七为五加科人参属多年生草本植物，又名参三七、田七等，道地产地为云南文山。三七是我国珍贵的药材，其有效成分包括皂苷、三七素、黄酮、多糖、聚炔醇、氨基酸、脂肪酸和环肽类等。目前对三七有效成分的研究利用主要集中在皂苷成分，皂苷成分提取后，其他有效成分被当作废渣废液被弃去。

目前对三七的研究主要集中在皂苷类有效成分的利用和使用，对其他有效成分的研究不足。三七道地产地云南文山的三七常年种植面积达到了12万亩左右，产量9000吨。每年用于提取三七总皂苷的三七约为1400吨，研究表明，皂苷提取后，三七多糖在三七渣中，测定三七多糖在三七中的含量约为2％，每年弃去三七多糖近30吨。目前对三七多糖的研究报道主要集中在提高免疫功能研究。因此，分类开发能充分发挥三七多糖功效的产品是非常必要的。

专利申请号为201210058942.6的发明专利公开了一种具有生理活性的三七多糖的制备方法及其应用。该方法应用树脂柱层析、活性碳和膜分离技术纯化等步骤，精制纯化得到三七多糖。用该发明的制备方法得到的三七多糖具有蛋白质、重金属和灰分低，质量稳定的特点，并具有调节免疫、保护肝损伤、降低血糖、抗肿瘤等生理活性，可单独或组合作为天然药物和健康产品的原料，但是该发明并没有进行纯化，也没有揭露三七多糖在促进细胞增殖药理活性方面的作用。

专利申请号为201510407936.0的发明专利公开了一种白背三七多糖及其在制备用于免疫调节和抗肿瘤的药物和功能食品中的应用，该发明制得的白背三七多糖可促进单核巨噬细胞株吞噬中性红和释放一氧化氮；可以促进b细胞的增殖和t细胞的增殖；还可明显提高免疫抑制小鼠脾及胸腺指数、提高在t细胞和b细胞的转化增殖，提高免疫抑制小鼠白细胞水平；可明显抑制肿瘤组织的生长；而且还能够保护机体，抑制体重的下降，并增加体重；可明显抑制静脉内皮细胞的迁移。而且多糖是白背三七的主要功效成分，具有多种保健功效，来源属于纯天然，无副作用，可开发成免疫调节、抗肿瘤、抗血管生成药品和保健品，但是该专利并没有就三七多糖进行纯化，具体应用方面主要集中在提高免疫功能、抗肿瘤等。

专利申请号为201210481377.4的发明专利公开了一种三七多糖提取物及其制备方法与制剂及应用，所述的三七多糖提取物是以提取三七总皂苷后的废渣为原料经提取、浓缩、精制、干燥、粉碎、检验步骤得到，其中三七多糖含量不低于15％。所述的三七多糖提取物的制备方法包括提取、浓缩、精制、干燥、粉碎、检验步骤，具体包括：将提取三七总皂苷后的废渣加入纯化水提取，过滤，浓缩，加入乙醇沉淀，过滤，精制，干燥得到目标物干燥品；所述的三七多糖提取物加入药用辅料制成散剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂或丸剂；所述的三七多糖提取物用于制备抗肿瘤药物和增强免疫力药物中的应用。但是该发明仅为初步提取，没有进行层析纯化，对于具体应用方面也没有涉及。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种中性三七多糖的提取纯化方法及促进细胞增殖药理活性研究与应用，以生产中提取过三七皂苷的三七废渣为原料，采用水提醇沉法，得到三七粗多糖，采用deaesepharosefastflow阴离子交换层析纯化三七粗多糖，经透析纯化，冷冻干燥后得到中性三七多糖pnpsi及酸性三七多糖pnpsii、酸性三七多糖pnpsiii、酸性三七多糖pnpsiv、酸性三七多糖pnpsv5个样品。测定三七粗多糖、中性三七多糖pnpsi及酸性三七多糖ii-v(酸性三七多糖pnpsii、酸性三七多糖pnpsiii、酸性三七多糖pnpsiv、酸性三七多糖pnpsv)的含量及分子量范围，研究其对人牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞以及人皮肤表皮细胞体外增殖的影响，证明中性三七多糖pnpsi促进牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞以及人皮肤表皮细胞增殖作用最明显，中性三七多糖可pnpsi作为开发新药的重要药物中间体，功能性保健食品的天然原料，而且还可作为日化产品的活性原料。

本发明提供了如下的技术方案：

一种中性三七多糖的提取纯化方法，采用提取过三七皂苷的三七废渣为原料，包括以下步骤：

(1)水提醇沉法提取三七粗多糖；

(2)deaesepharosefastflow阴离子交换层析及透析法纯化粗多糖，冷冻干燥法得到中性三七多糖pnpsi及酸性三七多糖pnpsii、酸性三七多糖pnpsiii、酸性三七多糖pnpsiv、酸性三七多糖pnpsv冻干粉。

优选的是，所述步骤(1)中水提醇沉法提取三七粗多糖具体方法为：取提取过三七总皂苷的废渣，加入水，沸水浴煮，收集滤液，离心，取上清；旋转浓缩后，静置，离心，弃沉淀，缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，放置后，抽滤得沉淀；乙醇洗涤沉淀，将乙醇挥发干后用适量水溶解，离心，收集上清，加入无水乙醇，放置后，抽滤得沉淀，乙醇洗涤沉淀，烘箱烘干，即得三七粗多糖。本发明的废渣由昆明制药集团股份有限公司提供。

上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中deaesepharosefastflow阴离子交换层析及透析法纯化粗多糖的方法包括装柱、平衡、上样、洗脱、透析和冷冻干燥。

上述任一方案优选的是，所述装柱的具体方法为：加入乙醇，抽滤，用水配成匀浆，采用湿法装柱，用玻璃棒引导匀浆沿柱内壁缓慢倒入柱内；打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，用水清洗层析柱边沿。

上述任一方案优选的是，所述湿法装柱的具体方法为：柱子塞入棉花，柱内加入蒸馏水并保持一小段液位，玻璃棒按压棉花祛除气泡。

上述任一方案优选的是，所述平衡的具体方法为：蒸馏水过滤膜，用多倍量体积水以冲洗柱子，直到流出液电导率和ph不变，平衡48小时。

上述任一方案优选的是，所述上样的具体方法为：三七粗多糖溶于少量蒸馏水中，离心，上清液过滤，上样；上样时，将层析柱出液口打开，待蒸馏水下移至柱床表面时，关闭出液口，用滴管沿柱内壁加入三七多糖溶液，打开出液口，让样品液全部流入柱子内部，并用少量蒸馏水冲洗柱内壁，然后行洗脱。

上述任一方案优选的是，所述洗脱的具体方法为：分别用水和不同浓度的nacl溶液梯度洗脱，蒽酮-硫酸法检测，直至无多糖检出，作deaesepharosefastflow阴离子交换层析柱洗脱曲线图，分别合并各流出峰溶液，中性三七多糖用水洗脱，酸性三七多糖用不同浓度nacl溶液洗脱。

上述任一方案优选的是，所述透析的具体方法为：分别将浓缩后的洗脱液装于透析袋中，用透析夹夹紧透析袋两端，放于蒸馏水中透析36h，每4h换一次水。

上述任一方案优选的是，所述透析袋在使用之前需要剪成小段，每段约10cm，放于蒸馏水中煮沸30min，洗三遍后再煮沸10min，之后蒸馏水洗干净；第二次用2％nahco3和1mmol/ledta煮沸后清洗。

上述任一方案优选的是，所述冷冻干燥的具体方法为：将洗脱液收集于离心管，-40℃预冻12h，放于冷冻干燥机冷冻干燥36h-38h，取出后加入约蒸馏水溶解，摇匀；-40℃预冻12h，放于冷冻干燥机24h；取出后封口于干燥器中保存。冷冻干燥机采用freezone4.5冷冻干燥机。真空度：0.05-0.07mbar；温度：-40℃。

上述任一方案优选的是，步骤(2)之后还包括(3)采用高效凝胶渗透色谱法测定三七粗多糖、中性三七多糖pnpsi及酸性三七多糖pnpsii、pnpsiii、pnpsiv、pnpsv的分子量。

上述任一方案优选的是，分子量的具体测定方法为：

①标准品溶液配制：dextrant系列标准品：右旋糖酐d0、d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、d8、d2000，分别取各标准品，加入流动相溶解，经滤膜过滤，取滤液注入液相色谱仪，记录色谱图，绘制标准多糖分子量-洗脱体积标准曲线；

②供试品溶液配制：三七粗多糖、中性三七多糖pnpsi、酸性三七多糖ii-v经滤膜过滤进样，记录色谱图，对照标准曲线计算分子量；

③根据系列分子量右旋糖苷标准品的液相色谱图，根据标准曲线计算的样品的分子量。

上述任一方案优选的是，所述中性三七多糖pnpsi的重均分子量mw为31590da，数均分子量mn为11170，多分散系数d为2.828。

上述任一方案优选的是，步骤(3)之后还包括(4)蒽酮-硫酸法测定三七粗多糖总糖含量、中性三七多糖pnpsi以及酸性三七多糖ii-v含量，dns法测定三七粗多糖中还原糖含量。

上述任一方案优选的是，所述三七粗多糖含量＝总糖含量-还原糖含量。

上述任一方案优选的是，所述中性三七多糖pnpsi的含量为93.6％。

本发明还提供一种上述中性三七多糖的提取纯化方法制备的中性三七多糖在促进牙周膜干细胞、成骨细胞以及人皮肤表皮细胞增殖方面的应用。

本发明还提供一种上述中性三七多糖的提取纯化方法制备的中性三七多糖应用于药物中间体。

本发明还提供一种上述中性三七多糖的提取纯化方法制备的中性三七多糖应用于保健食品。

本发明还提供一种上述中性三七多糖的提取纯化方法制备的中性三七多糖应用于日化产品。

本发明还提供一种上述方法制备的中性三七多糖pnpsi制备的牙膏，经过备料、混合、研磨、脱气步骤而获得牙膏膏体，其特征在于：包括以下重量百分比的组份：中性三七多糖pnpsi0.1-2.0％、摩擦剂2～60％、润湿剂2～55％、粘合剂0.2～2％、发泡剂1～3.5％、余量为去离子水。

优选的是，还包括香精0.5～2、糖精钠0.2～3.5％、苯甲酸钠0.1～0.3％、食用色素0～2％中的一种或几种。

上述任一方案优选的是，所述摩擦剂为二水合磷酸氢钙、二氧化硅、碳酸钙或氢氧化铝中的一种或几种。

上述任一方案优选的是，所述润湿剂为甘油、三梨醇或聚乙二醇中的一种或几种。

上述任一方案优选的是，所述粘合剂为羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、黄原胶、瓜尔胶或卡拉胶中的一种或几种。

上述任一方案优选的是，所述发泡剂为月桂醇硫酸酯钠、月桂酰肌氨酸钠中的至少一种。

本发明还提供一种上述方法制备的中性三七多糖pnpsi制备的面膜，采用面膜纸浸入面膜原液中得到，面膜原液采用三七中性多糖pnpsi，加水配制成浓度为0.5-2mg/ml的三七中性多糖pnpsi溶液即得。

本发明还提供一种上述的提取纯化方法制备的中性三七多糖pnpsi制备的手工皂，包括以下重量份的原料：中性三七多糖pnpsi2-4g、棕榈油180-200g、椰子油70-90g、橄榄油70-90g、甜杏仁油70-90g、小麦胚芽油50-70g、氢氧化钠60-80g、蒸馏水130-150g、金银花精油0.2-3g。

优选的是，包括以下重量份的原料：中性三七多糖pnpsi1-2g、棕榈油190g、椰子油85g、橄榄油80g、甜杏仁油80g、小麦胚芽油65g、氢氧化钠72g、、蒸馏水144g、金银花精油0.5-2g。

上述任一方案优选的是，包括以下重量份的原料：中性三七多糖pnpsi1.5g、棕榈油190g、椰子油85g、橄榄油80g、甜杏仁油80g、小麦胚芽油65g、氢氧化钠72g、蒸馏水144g、金银花精油1g。

本发明还提供一种采用中性三七多糖pnpsi制备手工皂的方法，制备方法包括以下步骤：

(1).氢氧化钠加入蒸馏水中溶解，然后将中性三七多糖pnpsi搅拌热溶解，降温至40℃-50℃，保持恒温，备用；

(2).棕榈油、椰子油、橄榄油、甜杏仁油、小麦胚芽油混合后置于烧杯内，水浴加热混合均匀，将步骤(1)得到的溶液缓缓倒入，保持水浴温度40℃-50℃并快速搅拌；

(3).金银花精油加入步骤(2)得到的混合物中充分搅拌，直至混合均匀；

(4).将步骤(3)得到的混合物倒入准备好的模具中，直至皂块完全凝固；

(5).将步骤(4)中皂块脱模得到三七多糖手工皂成品。

优选的是，步骤(1)中降温至45℃。

上述任一方案优选的是，步骤(2)中保持水浴温度45℃并用电动搅拌器快速搅拌，混合物开始由澄清变浑浊，持续将混合皂液搅拌到浓稠状态。

本发明以生产中提取过三七皂苷的三七废渣为原料，采用水提醇沉法，得到中性三七粗多糖，中性三七多糖含量可达到93.6％。采用deaesepharosefastflow阴离子交换层析纯化三七粗多糖，得到5个组分，经透析纯化，冷冻干燥后得到中性三七多糖pnpsi及酸性三七多糖pnpsii、pnpsiii、pnpsiv、pnpsv5个样品。测定三七粗多糖、中性三七多糖pnpsi及酸性三七多糖ii-v(酸性三七多糖pnpsii、酸性三七多糖pnpsiii、酸性三七多糖pnpsiv、酸性三七多糖pnpsv)的含量及分子量范围，研究其对人牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞以及人皮肤表皮细胞体外增殖的影响，证明中性三七多糖pnpsi促进牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞以及人皮肤表皮细胞增殖作用最明显，中性三七多糖可pnpsi作为开发新药的重要药物中间体，功能性保健食品的天然原料，而且还可作为化妆品的活性原料。三七粗多糖、中性三七多糖pnpsi以及酸性三七多糖ii-v对人牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞mc3t3-e1以及人皮肤表皮细胞体外增殖活性实验结果表明：中性三七多糖pnpsi在浓度高于35ug/ml，在体外可促人牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞mc3t3-e1以及人皮肤表皮细胞的增殖且对以上三种细胞的增值作用强于三七粗多糖及酸性三七多糖ii-v，故选用中性三七多糖pnpsi作为开发新药的重要药物中间体，功能性保健食品的天然原料，而且还可作为化妆品的活性原料。

附图说明

图1为三七粗多糖deaesepharosefastflow阴离子交换层析0-2mol/lnacl溶液梯度洗脱曲线；

图2为三七粗多糖hpgpc色谱图；

图3为中性三七多糖pnpsihpgpc色谱图；

图4为酸性三七多糖pnpsiihpgpc色谱图；

图5为酸性三七多糖pnpsiiihpgpc色谱图；

图6为酸性三七多糖pnpsivhpgpc色谱图；

图7为酸性三七多糖pnpsvhpgpc色谱图。

具体实施方式

为了进一步了解本发明的技术特征，下面结合具体附图和实施例对本发明进行详细地阐述。实施例只对本发明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上做出的任何非实质性的修改，都应属于本发明的保护范围。

实施例1：

一种中性三七多糖的提取纯化方法，具体包括以下步骤：

(1)三七粗多糖的提取：称取提取过三七总皂苷的废渣1kg，第一次加入10倍量水，沸水浴煮8h，收集滤液，第二次加入5倍量水，沸水浴8h。合并两次滤液，4500rpm离心5min，取上清。80℃旋转浓缩至原体积的1/8，静置24h，离心，弃沉淀，缓慢加入三倍无水乙醇，边加边搅拌，4℃放置12h，抽滤得沉淀。75％乙醇洗涤沉淀数次，将乙醇挥发干后用适量水溶解，离心，收集上清，加入三倍无水乙醇，4℃放置12h，抽滤得沉淀，75％乙醇洗涤沉淀，50℃烘箱烘干，即得三七粗多糖。

(2)deaesepharosefastflow阴离子交换层析纯化粗多糖

①装柱：。湿法装柱，柱子塞入棉花，柱内加入蒸馏水并保持一小段液位，玻璃棒按压棉花祛除气泡。用玻璃棒引导匀浆沿柱内壁缓慢倒入柱内，不能产生气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，用水清洗层析柱边沿。装柱时不能有断层，然后用蒸馏水平衡，柱规格为2.4×40cm。

②平衡：蒸馏水过0.45μm滤膜，用5倍柱体积水以一定流速冲洗柱子，直到流出液电导率和ph不变，平衡48小时。

③上样：三七粗多糖溶于少量蒸馏水中，配制成30mg/ml，4500rpm离心10min，上清液0.45μm滤头过滤，上样。上样时，将层析柱出液口打开，待蒸馏水下移至柱床表面时，关闭出液口，用滴管沿柱内壁加入三七多糖溶液，打开出液口，让样品液全部流入柱子内部，并用少量蒸馏水冲洗柱内壁，然后行洗脱。

④洗脱：分别用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、2mol/lnacl溶液梯度洗脱，各洗脱约5倍柱体积，流速为0.8ml/min，每管接2ml，蒽酮-硫酸法检测，直至无多糖检出，以洗脱管数为横坐标，吸光度值为纵坐标作deaesepharosefastflow阴离子交换层析柱洗脱曲线图，分别合并各流出峰溶液，减压浓缩至1/10的体积。用水洗脱部分为中性三七多糖；其余用不同浓度nacl溶液洗脱部分均为酸性三七多糖。三七粗多糖deaesepharosefastflow阴离子交换层析0-2mol/lnacl溶液梯度洗脱曲线见说明书附图1。

⑤透析：把透析袋剪成每段约10cm，放于蒸馏水中煮沸30min，洗三遍后再煮沸10min，蒸馏水洗干净。透析袋可以使用三次，第二次用2％nahco3和1mmol/ledta煮沸后清洗。分别将浓缩后的洗脱液装于分子量14000的透析袋中，约1/2体积，用透析夹夹紧透析袋两端，放于蒸馏水中透析36h，每4h换一次水。

⑥冷冻干燥：多糖在冷冻干燥过程中会吸潮，三七多糖洗脱液冻干工艺：将洗脱液收集于50ml离心管，装约16ml，-40℃预冻12h，放于冷冻干燥机36h，取出后加入约1ml蒸馏水溶解，摇匀。-40℃预冻12h，放于冷冻干燥机24h。取出后封口于干燥器中保存。

(3)分子量测定

①标准品溶液配制：dextrant系列标准品：右旋糖酐d0、d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、d8、d2000，标准分子量分别为180、2500、4600、7100、10000、21400、41100、84400、133800、2000000da。分别取各标准品10mg，加1ml流动相(0.1mol/lnacl)溶解，经0.22μm滤膜过滤，取滤液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，绘制标准多糖分子量-洗脱体积标准曲线。

②供试品溶液配制：三七粗多糖、中性三七多糖pnpsi、酸性三七多糖ii-v(10mg/ml)经0.22μm滤膜过滤进样，记录色谱图，对照标准曲线计算分子量。

③根据系列分子量右旋糖苷标准品的液相色谱图，所绘制的方程为:

logmw＝-0.7920v+12.1438，r²＝0.9761。

根据标准曲线计算的样品的分子量如表1所示，三七粗多糖、中性三七多糖pnpsi及酸性三七多糖pnpsii、pnpsiii、pnpsiv、pnpsv色谱图见说明书附图2-附图7。

表1三七粗多糖、中性三七多糖pnpsi及酸性三七多糖pnpsii～v分子量测定结果

由上述结果可知，中性三七多糖pnpsi重均分子量为31590，分子量分布宽度系数d为2.828，均小于其他组，表明中性多糖比其他组分子量分布窄。

(4)蒽酮-硫酸法测定三七多糖含量

蒽酮-硫酸法测定三七粗多糖总糖含量，dns法测定三七粗多糖中还原糖含量，三七粗多糖含量＝总糖含量-还原糖含量，三七粗多糖的多糖含量为63.86％；蒽酮-硫酸法测定中性三七多糖pnpsi以及酸性三七多糖ii-v含量见表2。

表2中性三七多糖pnpsi及酸性三七多糖pnpsii～v多糖含量及得率

由上表可以看出，中性三七多糖pnpsi含量最高，高达93.6％。

实施例2三七多糖对人牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞mc3t3-e1以及人皮肤表皮细胞体外增殖影响实验

一、mtt法测定三七多糖对人牙周膜干细胞体外增殖的影响

采用常规细胞培养法培养细胞。取7代对数生长期的人牙周膜干细胞，计数后调细胞浓度，接种于96孔板，100个/孔，每孔90μl，co2培养箱培养12小时后分别加pnpsi、pnpsii、pnpsiii、pnpsiv以及三七粗多糖溶液各10μl，使作用于细胞的终浓度为6.72mg/ml、4.48mg/ml、2.24mg/ml、1.12mg/ml、560ug/ml、280ug/ml、140ug/ml、70ug/ml，每个浓度设6个平行孔，阴性对照为等体积mem-alpha培养液，加生理盐水10μl。48小时后，加mtt溶液(5mg/ml)20μl每孔，继续培养4小时，每孔加入150μldmso充分溶解，用酶标仪测定各孔的a570值。计算不同浓度的a570的od值，实验结果见表3：

表3三七多糖对人牙周膜干细胞体外增殖的影响实验结果(n＝6)

注：*p<0.05；**p<0.01

中性三七多糖pnpsⅰ在浓度35～1120ug/ml，对人牙周膜干细胞的增殖有促进作用；pnpsii(酸性多糖)在浓度17.5～70ug/ml，对人牙周膜干细胞的增殖有促进作用；pnpsiii(酸性多糖)与pnpsiv(酸性多糖)对人牙周膜干细胞的增殖有抑制作用；三七粗多糖在浓度70ug/ml，对人牙周膜干细胞的增殖有促进作用。中性三七多糖pnpsⅰ对人牙周膜干细胞的增殖促进作用最明显。

二、mtt法测定三七多糖对小鼠成骨细胞mc3t3-e1mtt体外增殖的影响

采用常规细胞培养法培养细胞。取7代对数生长期的小鼠成骨细胞，计数后调细胞浓度，接种于96孔板，100个/孔，每孔90μl，co2培养箱培养12小时后分别加pnpsi、pnpsii、pnpsiii、pnpsiv以及三七粗多糖溶液各10μl，使作用于细胞的终浓度为1.12mg/ml、560ug/ml、280ug/ml、140ug/ml、70ug/ml、35ug/ml、17.5ug/ml，每个浓度设6个平行孔，阴性对照为等体积mem-alpha培养液，加生理盐水10μl。48小时后，加mtt溶液(5mg/ml)20μl每孔，继续培养4小时，每孔加入150μldmso充分溶解，用酶标仪测定各孔的a570值。计算不同浓度的a570的od值，实验结果见表4：

表4三七多糖对小鼠成骨细胞mc3t3-e1体外增殖影响实验结果(n＝6)

注：*p<0.05；**p<0.01

中性三七多糖pnpsi、pnpsii(酸性多糖)、pnpsiii(酸性多糖)、pnpsiv(酸性多糖)以及三七粗多糖对小鼠成骨细胞mc3t3-e1体外增殖均有促进作用，实验结果证明中性三七多糖pnpsi促进作用最明显。

三、测定三七多糖对人皮肤表皮细胞体外增殖的影响

培养人正常皮肤表皮细胞(购自北京清源昊生物科技公司)，培养基为eplife

加hkgs辅助生长因子，隔日换液。细胞长满瓶后传代，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔平底板，每孔100μl，置于37℃、5％co2培养箱中培养。将细胞分为10组，每组为6孔。细胞培养24h后，每组细胞分别加入加pnpsi、pnpsii、pnpsiii、pnpsiv以及三七粗多糖溶液各10μl，使作用于细胞的终浓度为1.12mg/ml、560ug/ml、280ug/ml、140ug/ml、70ug/ml、35ug/ml、17.5ug/ml，的表皮细胞培养液100μl，阴性对照组直接加入表皮细胞培养液100μl。继续培养24h后，加入cck8溶液，每孔20μl，继续培养2.5h，用酶标检测仪测定其细胞吸光值(od值波长450nm，参考波长600nm)，实验结果见表5：

表5三七多糖对人皮肤表皮细胞体外增殖的影响实验结果(n＝6)

注：*p<0.05；**p<0.01

中性三七多糖pnpsi在浓度35～1120ug/ml，对人皮肤表皮细胞体外增殖有促进作用；pnpsii(酸性多糖)在浓度35～1120ug/ml，对人皮肤表皮细胞体外增殖有促进作用；三七粗多糖(酸性多糖)在浓度140～1120ug/ml，对人皮肤表皮细胞体外增殖有促进作用；pnpsiii(酸性多糖)和pnpsiv(酸性多糖)对人皮肤表皮细胞体外增殖无影响。

上述实验，研究三七粗多糖、中性三七多糖pnpsi及酸性三七多糖ii-v(酸性三七多糖pnpsii、pnpsiii、pnpsiv、pnpsv)对人牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞以及人皮肤表皮细胞体外增殖的影响，实验结果证明中性三七多糖pnpsi促进牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞以及人皮肤表皮细胞增殖作用最明显。

三七粗多糖、中性三七多糖pnpsi以及酸性三七多糖ii-v对人牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞mc3t3-e1以及人皮肤表皮细胞体外增殖活性实验结果表明中性三七多糖pnpsi在浓度为35ug/ml～1120ug/ml，可促进人牙周膜干细胞的增殖；在浓度为35ug/ml～1120ug/ml，可促进小鼠成骨细胞mc3t3-e1的增殖；在浓度为35ug/ml～1120ug/ml，可促进人皮肤表皮细胞增殖，对以上三种细胞的增值作用强于三七粗多糖及酸性三七多糖ii-v，故选用中性三七多糖pnpsi作为开发新药的重要药物中间体，功能性保健食品的天然原料，而且还可作为化妆品的活性原料。

实施例3

用含量最高且促进细胞增殖活性最显著的三七中性多糖pnpsi为原料，制备三七多糖牙膏。

本实施例公开了一种含三七中性多糖pnpsi的牙膏及其制备方法和应用。三七多糖牙膏包括三七中性多糖pnpsi和摩擦剂、润湿剂、粘合剂、发泡剂、香精、糖精钠、苯甲酸钠、食用色素、去离子水。牙膏中的活性成分为重量百分比为0.1-2.0％的三七中性多糖pnpsi；摩擦剂为占牙膏重量百分比为2～60％的二水合磷酸氢钙、二氧化硅、碳酸钙、氢氧化铝中的一种或几种；润湿剂为占牙膏重量百分比为2～55％的甘油、三梨醇、聚乙二醇中的一种或几种；粘合剂为占牙膏重量百分比为0.2～2％的羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、黄原胶、瓜尔胶、卡拉胶的一种或几种；发泡剂为占牙膏重量百分比为1～3.5％的月桂醇硫酸酯钠(十二烷基硫酸钠)、月桂酰肌氨酸钠(十二酰基肌氨酸钠)的一种或几种；香精占牙膏重量百分比为0.5～2％；糖精钠占牙膏重量百分比为0.2～3.5％；苯甲酸钠占牙膏重量百分比为0.1～0.3％；牙膏用色素占牙膏重量百分比为0～2％；余量为去离子水。

三七多糖牙膏的制备方法包括备料、混合、研磨、脱气步骤而获得牙膏膏体。

三七多糖牙膏除洁齿外，本发明具有防治牙周炎、牙龈炎、牙龈出血、口腔溃疡、延缓牙龈萎缩的功效。由于本发明的三七中性多糖pnpsi为天然植物提取物，不会对口腔正常菌群生态环境造成破会，长期使用能促进口腔理想微生物群的形成，增强人体对外源性病原菌的抵抗能力，改善口腔健康状况。

实施例4

用含量最高且促进细胞增殖活性最显著的三七中性多糖pnpsi为原料，制备三七多糖面膜。

本实施例公开了一种含三七中性多糖pnpsi的面膜及其制备方法和应用。面膜采用面膜纸浸泡于中性三七多糖面膜原液内制成。该实施例所述的中性三七多糖面膜原液的制备为称取三七中性多糖pnpsi适量，加水配制成浓度为0.5-2mg/ml三七中性多糖pnpsi溶液即得。本发明能促进面部细胞的修复、增殖及活性，使肌肤更有弹性。

实施例5

用含量最高且促进细胞增殖活性最显著的三七中性多糖pnpsi为原料，制备三七多糖手工皂。

本实施例提供的中性三七多糖手工皂，包括以下原料：中性三七多糖pnpsi1-2g、棕榈油190g、椰子油85g、橄榄油80g、甜杏仁油80g、小麦胚芽油65g、氢氧化钠72g、、蒸馏水144g、金银花精油0.5-2g。

其制备工艺为：

(1)将所需氢氧化钠慢慢加入蒸馏水中溶解，一直搅拌到溶液变得透明为止，然后将三七多糖搅拌热溶解，放置使其降温至45℃，保持该温度，备用；

(2)将棕榈油、椰子油、橄榄油、甜杏仁油、小麦胚芽油混合后置于烧杯内，45℃水浴加热混合均匀，将步骤(1)中的溶液缓缓倒入油脂中发生皂化反应，保持水浴温度45℃并用电动搅拌器快速搅拌，混合物开始由澄清变浑浊，持续将混合皂液搅拌到浓稠状态；

(3)将金银花精油加入步骤(2)混合物中充分搅拌，直至混合均匀；

(4)停止搅拌，稍放凉后将步骤(3)得到的混合物倒入准备好的模具中，并置于阴凉通风处干燥，直至皂块完全凝固；

(5)将步骤(4)中皂块脱模就得到三七多糖手工皂成品。