一种测序样本制备系统及方法与流程

本发明涉及基因测序技术领域，特别涉及一种测序样本制备系统及方法。

背景技术：

从1977年第一代dna测序技术(sanger法)，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展。

第一代dna测序技术用的是1975年由sanger和coulso开创的链终止法或者是1976-1977年由maxam和gilbert发明的化学法(链降解)。并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体x174的，全长5375个碱基。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的sanger法为其测序基础。

第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999％，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以roche公司的454技术、illumina公司的solexa，hiseq技术和abi公司的solid技术为代表的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。

以roche454测序系统为例，它是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理是：

(1)dna测序样本制备

454测序系统的文件构建是利用喷雾法将待测dna打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测dna变性后用杂交引物进行pcr扩增，连接载体，构建单链dna文库。

(2)emulsionpcr(乳液pcr)

454的dna扩增过程是将这些单链dna结合在水油包被的直径约28um的微球上，并在其上面孵育、退火。

(3)焦磷酸测序

测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有dna的磁珠，接着将磁珠放在一种ptp平板上。将一种比ptp板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链dna为模板，每次反应加入一种dntp进行合成反应。如果dntp能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的atp硫酸化学酶反应生成atp。生成的atp和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由ptp板另一侧的ccd照相机记录，最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。

目前还有一种基于半导体芯片的新一代革命性测序技术——iontorrent。该技术使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片。这一技术的发明人同时也是454测序技术的发明人之一，jonathanrothberg，它的文库和样本制备跟454技术很像，只是测序过程中不是通过检测焦磷酸荧光显色，而是通过检测h+信号的变化来获得序列碱基信息。iontorrent相比于其他测序技术来说，不需要昂贵的物理成像等设备，因此，成本相对来说会低，体积也会比较小，同时操作也要更为简单，速度也相当快速，除了两天文库制作时间，整个上机测序可在2-3.5小时内完成，不过整个芯片的通量并不高，目前是10g左右，但非常适合小基因组和外显子验证的测序。

与一般的测序平台不同，半导体芯片测序的核心是由大规模离子敏感场效应晶体管(isfet)阵列组成的半导体芯片，其中包含了数百万个孔和离子感应器。其核心原理是利用isfet测量碱基在dna链上延伸时释放质子/氢离子导致的ph值的变化。用isfet测量ph值或生物分子等技术已经是广为人知技术，相关的研究也一直方兴未艾。

半导体芯片上的每一个传感单元有一个微球槽，每个微球槽原则上只能放入一个表面携带某一条dna片段克隆簇的微球(可以包括各种磁性微球、乳胶微球、水凝胶微球等)。

半导体基因测序具体的测序原理为：

在每一个isfet传感单元上，通过cmos标准工艺技术开一个微球槽，微球槽的大小仅能容纳一个微球；

在每一个微球上通过聚合酶链式反应(pcr)技术，获得大量序列相同的dna片段(10,000以上)，这样可以增加每次碱基配对并酶促合成时释放出来的氢离子总量，达到增强测试信号的目的。

用isfet探测酶促合成时释放出来的氢离子从而获得相应微球所装载核酸的序列。

在二代基因测序技术中，采用一定的方式制备数百亿计的高质量单分子文库是测序前必不可少的步骤。当前各种测序样本制备过程至少存在以下问题：第一，无法整合测序样本制备的过程，需要通过多个单独的制备按部就班，制备效率不高；第二，整个制备过程时间还是较长，基本是天为单位；第三，整个制备过程比较复杂，制备的质量直接影响到测序数据的质量。在测序样本制备过程中：乳液的均一度、pcr扩增热循环效率和温度控制、微珠收集率等是重要的质量指标。

技术实现要素：

本发明实施方式的目的在于提供一种测序样本制备系统及方法，可以整合测序样本制备的过程，提高制备效率。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种测序样本制备系统，包括：乳液制备模块、基因扩增模块、破乳富集模块；

所述乳液制备模块用于制备油包水乳液；

所述基因扩增模块用于对由所述乳液制备模块制备的油包水乳液进行基因扩增；

所述破乳富集模块用于对由所述基因扩增模块进行基因扩增后的油包水乳液进行油水分离。

本发明的实施方式还提供了一种测序样本制备方法，包括：

利用乳液制备模块制备油包水乳液；

利用基因扩增模块对由所述乳液制备模块制备的油包水乳液进行基因扩增；

利用破乳富集模块对由所述基因扩增模块进行基因扩增后的油包水乳液进行油水分离。

本发明实施方式相对于现有技术而言，通过乳液制备模块、基因扩增模块、破乳富集模块的依次配合，整合了测序样本制备的过程，提高了制备效率。

另外，在该测序样本制备系统中，所述乳液制备模块包括：油相提供装置、水相提供装置、毛细管装置；

所述毛细管装置具有供油相流动的油相通道，以及供水相流动的水相通道；

所述油相提供装置用于向所述油相通道提供油相；

所述水相提供装置用于向所述水相通道提供水相；

所述油相通道与所述水相通道至少汇聚于一条出液通道，用于使由所述油相提供装置提供的油相与由所述水相提供装置提供的水相在所述出液通道内相互剪切并形成油包水乳液；

所述出液通道和所述基因扩增模块连接，用于将所形成的油包水乳液输送至所述基因扩增模块。因此，在乳液制备过程中，通过对毛细管装置的结构设计和动力设计，即通过油相通道、水相通道以及出液通道的汇聚结构，以及油相提供装置和水相提供装置的动力支持，实现提升生成液滴的均一性和可靠性的技术效果。

另外，在该测序样本制备系统中，所述基因扩增模块包括变性恒温柱、延伸恒温柱、导液管；

所述导液管具有导液入口和导液出口，所述导液入口用于接收油包水乳液，所述导液出口用于排放油包水乳液；

所述导液管间隔式缠绕在所述变性恒温柱和所述延伸恒温柱上，用于使在所述导液管内流动的油包水乳液分别与所述变性恒温柱和所述延伸恒温柱进行热传导，并且所述导液管在所述变性恒温柱上的缠绕长度与在所述延伸恒温柱上的缠绕长度之比1：1至1：20。通过使用双温区恒温控制技术，有效实现油包水乳液边生成边扩增，比传统的反复升温降温方法效率更高，整个扩增时间可以减少到10分钟至90分钟，并且油包水乳液在流动过程中实现扩增，避免静止状况下油包水乳液堆叠并在重力作用下发生的液滴融合现象。

另外，在该测序样本制备系统中，所述变性恒温柱的工作温度为85-97℃。

另外，在该测序样本制备系统中，所述延伸恒温柱的工作温度为50-75℃。

另外，在该测序样本制备系统中，所述基因扩增模块还包括第一隔热层，所述第一隔热层设置在所述变性恒温柱和所述延伸恒温柱之间，用于隔绝二者之间的热传导。

另外，在该测序样本制备系统中，所述基因扩增模块还包括退火恒温柱；

所述导液管间隔式缠绕在所述变性恒温柱、所述延伸恒温柱和所述退火恒温柱上，用于使在所述导液管内流动的油包水乳液分别与所述变性恒温柱、所述延伸恒温柱和所述退火恒温柱分别进行热传导，并且所述导液管在所述变性恒温柱上的缠绕长度与在所述延伸恒温柱上的缠绕长度与在所述退火恒温柱上的缠绕长度之比1：1：1至1：20：2。通过使用三温区恒温控制技术，有效实现油包水乳液边生成边扩增，比传统的反复升温降温方法效率更高，整个扩增时间可以减少到10分钟至90分钟，并且油包水乳液在流动过程中实现扩增，避免静止状况下油包水乳液堆叠并在重力作用下发生的液滴融合现象。

另外，在该测序样本制备系统中，所述退火恒温柱的工作温度为45-68℃。

另外，在该测序样本制备系统中，所述基因扩增模块还包括第二隔热层，所述第二隔热层设置在所述变性恒温柱、所述延伸恒温柱和所述退火恒温柱之间，用于隔绝三者之间的热传导。

另外，在该测序样本制备方法中，所述基因扩增模块包括变性恒温柱、延伸恒温柱、导液管；

所述导液管具有导液入口和导液出口，所述导液入口用于接收油包水乳液，所述导液出口用于排放油包水乳液；

所述导液管间隔式缠绕在所述变性恒温柱和所述延伸恒温柱上，用于使在所述导液管内流动的油包水乳液分别与所述变性恒温柱和所述延伸恒温柱进行热传导，并且所述导液管在所述变性恒温柱上的缠绕长度与在所述延伸恒温柱上的缠绕长度之比1：1至1：20；

并且，在所述利用基因扩增模块对由所述乳液制备模块制备的油包水乳液进行基因扩增的步骤中，具体包括以下子步骤：

控制油包水乳液流经受所述变性恒温柱影响的导液管的时间为10到600秒；

控制油包水乳液流经受所述延伸恒温柱影响的导液管的时间为30到300秒；

将由所述导液出口排出的油包水乳液输送至所述导液入口，并重复上述子步骤20至60次。

另外，在该测序样本制备方法中，基因扩增还包括退火恒温柱；

所述导液管间隔式缠绕在所述变性恒温柱、所述延伸恒温柱和所述退火恒温柱上，用于使在所述导液管内流动的油包水乳液分别与所述变性恒温柱、所述延伸恒温柱和所述退火恒温柱分别进行热传导，并且所述导液管在所述变性恒温柱上的缠绕长度与在所述延伸恒温柱上的缠绕长度与在所述退火恒温柱上的缠绕长度之比1：1：1至1：20：2；

并且，在所述利用基因扩增模块对由所述乳液制备模块制备的油包水乳液进行基因扩增的步骤中，具体包括以下子步骤：

控制油包水乳液流经受所述变性恒温柱影响的导液管的时间为10到600秒；

控制油包水乳液流经受所述延伸恒温柱影响的导液管的时间为30到300秒；

控制油包水乳液流经受所述退火恒温柱影响的导液管的时间10到600秒；

将由所述导液出口排出的油包水乳液输送至所述导液入口，并重复上述子步骤20至60次。

另外，在所述利用破乳富集模块对由所述基因扩增模块进行基因扩增后的油包水乳液进行油水分离的步骤中，具体包括：

向油包水乳液中添加破乳剂，并进行离心破乳；

对完成离心破乳的液滴去除上清，并收集；

对完成收集的液滴离心去除上清，并添加清洗剂，清洗2～4次；

对完成清洗的液滴离心去除上清，加入链霉亲和素修饰的磁珠，温育600～1800秒；

对完成温育的液滴磁性富集，去除上清，添加变性缓冲液并混匀，添加ph中和缓冲液并混匀；

离心去除上清，得到测序样本。提升油水分离的效果，生成的液滴更易被收集。

另外，在该测序样本制备方法中，所述清洗剂的成分包括10mmtris-hcl、1mmedta、2mnacl。

另外，在该测序样本制备方法中，所述破乳剂成分包括浓度为5-15％的十二烷基硫酸钠，以及浓度为1-50％的1-丁基-2-吡咯烷酮、1-乙基-2-吡咯烷酮、1-辛基-2-吡咯烷酮、1-癸基-2-吡咯烷酮中的任意一种。以进一步提升油水分离的效果。

另外，在该测序样本制备方法中，所述变性缓冲液包含100～400mm的naoh，以及浓度为0.01～0.5％的tween20。

附图说明

图1是本发明第一实施方式中的乳液制备模块的结构示意图；

图2是本发明第一实施方式中的基因扩增模块的结构示意图；

图3是本发明第一实施方式中的基因扩增模块的俯视结构示意图；

图4是本发明第二实施方式中的乳液制备模块的结构示意图；

图5是本发明第三实施方式中的乳液制备模块的结构示意图；

图6是本发明第四实施方式中的基因扩增模块的俯视结构示意图；

图7是本发明第五实施方式中的测序样本制备方法的流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。

本发明的第一实施方式涉及一种测序样本制备系统，包括：乳液制备模块1、基因扩增模块2、破乳富集模块，其中，乳液制备模块1用于制备油包水乳液；基因扩增模块2用于对由乳液制备模块1制备的油包水乳液进行基因扩增；破乳富集模块用于对由基因扩增模块2进行基因扩增后的油包水乳液进行油水分离。本发明实施方式所提供的测序样本制备系统，通过乳液制备模块1、基因扩增模块2、破乳富集模块的依次配合，在使用时，利用乳液制备模块1制备油包水乳液；利用基因扩增模块2对由乳液制备模块1制备的油包水乳液进行基因扩增；利用破乳富集模块对由基因扩增模块2进行基因扩增后的油包水乳液进行油水分离，从而整合了测序样本制备的过程，提高了制备效率。

具体来说，在本实施方式的测序样本制备系统中，乳液制备模块1包括：油相提供装置11、水相提供装置12、毛细管装置13。

该毛细管装置13为一微流控芯片，材料选用疏水亲油材料，如图1所示，它具有供油相流动的油相通道131，以及供水相流动的水相通道132，油相通道131与水相通道132汇聚于一条出液通道133。

油相提供装置11和水相提供装置12为现有技术中的气泵或液压泵，其中，油相提供装置11用于向油相通道131提供油相，水相提供装置12用于向水相通道132提供水相，在使用时，由油相提供装置11提供的油相与由水相提供装置12提供的水相在出液通道133内相互剪切并形成油包水乳液，即为液滴。剪切原理如下：水油的剪切通过微流控芯片装置实现，通过外置气泵或液压泵为动力，分别驱动水和油互不相溶的两相液体在特定结构的微管道中流动过程中产生的流动剪切力与表面张力之间的相互作用下水相被油相分割成离散的纳升或皮升级的单分散液滴。通过调控水油两相液体的驱动力的大小即可直接调整生成液滴的大小。毛细管装置13的结构设计会影响液滴的生成结果。同时，出液通道133和基因扩增模块2连接，用于将所形成的油包水乳液输送至基因扩增模块2。通过上述内容不难发现，本实施方式的测序样本制备系统在乳液制备过程中，通过对毛细管装置13的结构设计和动力设计，即通过油相通道131、水相通道132以及出液通道133的汇聚结构，以及油相提供装置11和水相提供装置12的动力支持，实现提升生成液滴的均一性和可靠性的技术效果。利用微流控芯片制备出尺寸均一的单分散液滴，减少由于不均匀液相中微小或超大液滴导致的模板损失及多克隆微球、无扩增微球等无效微球的比例，提高了单分子文库的制备效率。

值得补充说明的是，水相的制备：包括dna聚合酶，dntps，偶联有引物序列的微球，连接好接头的待测dna以及dna聚合酶反应所需的缓冲液、盐离子、表面活性剂等成分。油相的制备：可以包括矿物油、tegosoft、氟化液、表面活性剂等成分。

另外，在该测序样本制备系统中，如图2和图3所示，基因扩增模块2包括变性恒温柱21、延伸恒温柱22、导液管23。其中，导液管23具有导液入口231和导液出口232，导液入口231用于接收油包水乳液，导液出口232用于排放油包水乳液。导液管23为一整根细长的管道，其间隔式缠绕在变性恒温柱21和延伸恒温柱22上，用于使在导液管23内流动的油包水乳液分别与变性恒温柱21和延伸恒温柱22进行热传导，也可以说，在导液管23的延伸方向上，导液管23先缠绕在变性恒温柱21上，再缠绕在延伸恒温柱22上，之后又继续缠绕在变性恒温柱21上，实现间隔式缠绕，值得指出的是，导液管23在变性恒温柱21上的缠绕长度与在延伸恒温柱22上的缠绕长度之比1：1至1：20。可以理解的是，该种方式通过使用双温区恒温控制技术，有效实现油包水乳液边生成边扩增，比传统的反复升温降温方法效率更高，整个扩增时间可以减少到10分钟至90分钟，并且油包水乳液在流动过程中实现扩增，避免静止状况下油包水乳液堆叠并在重力作用下发生的液滴融合现象。优选的，在该测序样本制备系统中，变性恒温柱21的工作温度为85-97℃；同样优选的，延伸恒温柱22的工作温度为50-75℃。

值得指出的是，在该测序样本制备系统中，基因扩增模块2还包括第一隔热层24，第一隔热层24设置在变性恒温柱21和延伸恒温柱22之间，用于隔绝二者之间的热传导。第一隔热层24可由现有技术中的任意一种隔热材料制成。

本发明的第二实施方式涉及一种测序样本制备系统，与第一实施方式基本相同，其区别之处在于，在该测序样本制备系统中，该毛细管装置13如图4所示，它具有供油相流动的油相通道131，以及供水相流动的水相通道132，油相通道131与水相通道132汇聚于两条出液通道133。

本发明的第三实施方式涉及一种测序样本制备系统，与第一实施方式基本相同，其区别之处在于，在该测序样本制备系统中，该毛细管装置13为一微流控芯片，如图5所示，它具有供油相流动的油相通道131，以及供水相流动的水相通道132，油相通道131与水相通道132汇至少聚于一条出液通道133。

本发明的第四实施方式涉及一种测序样本制备系统，与第一实施方式基本相同，其区别之处在于，在该测序样本制备系统中，如图6所示，基因扩增模块2还包括退火恒温柱25。具体来说，导液管23间隔式缠绕在变性恒温柱21、延伸恒温柱22和退火恒温柱25上，用于使在导液管23内流动的油包水乳液分别与变性恒温柱21、延伸恒温柱22和退火恒温柱25分别进行热传导，也可以说，在导液管23的延伸方向上，导液管23先缠绕在变性恒温柱21上，再缠绕在延伸恒温柱22上，再缠绕在退火恒温柱25上，之后又继续缠绕在变性恒温柱21上，实现间隔式缠绕，并且导液管23在变性恒温柱21上的缠绕长度与在延伸恒温柱22上的缠绕长度与在退火恒温柱25上的缠绕长度之比1：1：1至1：20：2。通过使用三温区恒温控制技术，有效实现油包水乳液边生成边扩增，比传统的反复升温降温方法效率更高，整个扩增时间可以减少到10分钟至90分钟，并且油包水乳液在流动过程中实现扩增，避免静止状况下油包水乳液堆叠并在重力作用下发生的液滴融合现象。优选的，在该测序样本制备系统中，退火恒温柱25的工作温度为45-68℃。可以理解的是，在该测序样本制备系统中，基因扩增模块2还包括第二隔热层24’(可参照第一隔热层24的理解)，本实施方式中的第二隔热层24’为一实心柱体，第二隔热层24’设置在变性恒温柱21、延伸恒温柱22和退火恒温柱25之间，用于隔绝三者之间的热传导。

本发明的第五实施方式涉及一种测序样本制备方法，结合上述实施方式，如图7所示，包括：

s1利用乳液制备模块1制备油包水乳液；

s2利用基因扩增模块2对由乳液制备模块1制备的油包水乳液进行基因扩增；

s3利用破乳富集模块对由基因扩增模块2进行基因扩增后的油包水乳液进行油水分离。本发明实施方式相对于现有技术而言，整合了测序样本制备的过程，提高了制备效率。

进一步来说，在该测序样本制备方法中，基因扩增模块2包括变性恒温柱21、延伸恒温柱22、导液管23；

导液管23具有导液入口231和导液出口232，导液入口231用于接收油包水乳液，导液出口232用于排放油包水乳液；

导液管23间隔式缠绕在变性恒温柱21和延伸恒温柱22上，用于使在导液管23内流动的油包水乳液分别与变性恒温柱21和延伸恒温柱22进行热传导，并且导液管23在变性恒温柱21上的缠绕长度与在延伸恒温柱22上的缠绕长度之比1：1至1：20；

并且，在s2利用基因扩增模块2对由乳液制备模块1制备的油包水乳液进行基因扩增的步骤中，具体包括以下子步骤：

控制油包水乳液流经受变性恒温柱21影响的导液管23的时间为10到600秒；

控制油包水乳液流经受延伸恒温柱22影响的导液管23的时间为30到300秒；

将由导液出口232排出的油包水乳液输送至导液入口231，并重复上述子步骤20至60次。

进一步来说，在该测序样本制备方法中，基因扩增还包括退火恒温柱25；

导液管23间隔式缠绕在变性恒温柱21、延伸恒温柱22和退火恒温柱25上，用于使在导液管23内流动的油包水乳液分别与变性恒温柱21、延伸恒温柱22和退火恒温柱25分别进行热传导，并且导液管23在变性恒温柱21上的缠绕长度与在延伸恒温柱22上的缠绕长度与在退火恒温柱25上的缠绕长度之比1：1：1至1：20：2；

并且，在利用基因扩增模块2对由乳液制备模块1制备的油包水乳液进行基因扩增的步骤中，具体包括以下子步骤：

控制油包水乳液流经受变性恒温柱21影响的导液管23的时间为10到600秒；

控制油包水乳液流经受延伸恒温柱22影响的导液管23的时间为30到300秒；

控制油包水乳液流经受退火恒温柱25影响的导液管23的时间10到600秒；

将由导液出口232排出的油包水乳液输送至导液入口231，并重复上述子步骤20至60次。

进一步来说，在利用破乳富集模块对由基因扩增模块2进行基因扩增后的油包水乳液进行油水分离的步骤中，具体包括：

向油包水乳液中添加破乳剂，并进行离心破乳；

对完成离心破乳的液滴去除上清，并收集；

对完成收集的液滴离心去除上清，并添加清洗剂，清洗2～4次；

对完成清洗的液滴离心去除上清，加入链霉亲和素修饰的磁珠，温育600～1800秒；

对完成温育的液滴磁性富集，去除上清，添加变性缓冲液并混匀，添加ph中和缓冲液并混匀；

离心去除上清，得到测序样本。提升油水分离的效果，生成的液滴更易被收集。

具体来说，经基因扩增模块2的油包水乳液被收集到专用塑料试管里，同时加入破乳剂，将试管放入离心机，在离心机和破乳剂的共同作用下，实现油包水液滴的破乳过程。在破乳剂的作用下，分离出来的微球更容易沉到试管，便于提纯分离。

其中，破乳富集的主要步骤有：

(1)对生成的液滴添加适量破乳剂，并进行离心；

(2)将完成离心破乳的液滴移去上清，收集到专用试管；

(3)离心去除上清，添加适量清洗剂，主要成分10mmtris-hcl(ph7.5)，1mmedta，2mnacl，清洗2～4次；

(4)离心去除上清，加入链霉亲和素修饰的磁珠，温育10～30分钟；

(5)磁性富集，去上清，添加变性缓冲液(100～400mmnaoh,0.01～0.5％tween20)上下吹打混匀，然后添加相应量的ph中和缓冲液(1nhcl)，吹打混匀；

(6)离心去除上清，试管底部剩余部分即为半导体基因测序所需要的文库。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。