一种亚型Ph‑likeALL的检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种亚型ph-likeall的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

急性淋巴细胞白血病（简称all）是儿童最常见的肿瘤，发病率随年龄的增长而降低，目前重现性染色体改变是all的重要标志，包括染色体重组、结构改变等。多年来，临床通过结合上述染色体变异特征，对all进行危险分层治疗，使得all的治疗效果得到了很大得改善，其中儿童all的5年生存率提高到了85%，然而仍有部分患者治疗预后差，all的复发难治性使得该病依然是儿童及成人主要的致死疾病之一。

随着全基因组测序、基因表达谱芯片等生物技术在all疾病研究中的大量运用，临床对于all有了更多的认识，其中由欧美研究人员发现的一类特殊的all亚型ph-likeall（又称bcr-abl1likeall）是近年来重要的临床发现之一，对于all的危险分层及治疗提供了新的参考依据。

ph-likeall，是根据基因表达谱鉴定的一组疾病，其基因表达谱与bcr-abl1阳性all相似，但不表达bcr-abl1，所以称之为bcr-abl1-likeall，又称为ph-likeall。此类all主要见于急性前体b细胞淋巴细胞白血病（bcp-all），一般缺少bcp-all中典型的基因及染色体变异（etv6-runx1、e2a-pbx1、erg和mll重排、超二倍体等）且经常会伴有高风险临床特征。研究发现，ph-likeall约占sr（标危）和hr（高危）儿童b-all的15%，在青年all中约为27.4%。与bcr-abl1阳性all相似，ph-likeall患者预后差，常规化疗效果不佳，易复发。目前，国内外市场上没有一款产品专门用于检测ph-likeall。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺陷，提供一种亚型ph-likeall的检测试剂盒及其检测方法，能够全面准确地检测ph-likeall。

本发明的技术方案是：一种亚型ph-likeall的检测试剂盒，包括12组荧光探针和复染液；12组所述荧光探针分别为abl1，abl2，csf1r，pdgfrb，crlf2，jak2，epor，il2rb，ntrk3，ptk2b，tslp和tyk2；所述复染液由以下重量份数的组分组成：革兰氏染色液5~7份，生理盐水1~3份，纤维素0.2~0.6份，荧光素0.5~0.7份，磷酸一铵0.1~0.3份。

绝大部分ph-likeall患者有染色体重排或其他的遗传改变，可激活细胞因子受体或激酶信号。重排基因包括abl1，abl2，crlf2，csf1r，epor，jak2，ntrk3，pdgfrb，ptk2b，il2rb，tslp和tyk2。abl1，abl2，csf1r，jak2表达和pdgfrb融合基因导致细胞因子独立性扩增和磷酸化stat5激活。将上述重排基因进行标记得到荧光探针，与复染液制成试剂盒。

复染液在变性杂交后添加，其效果在复染及观察过程中体现。复染液采用革兰氏染色液为主要成分，荧光素增加荧光效果，添加生理盐水可保持荧光探针的标记显色效果；纤维素促进细胞的均匀分散，磷酸一铵则加快异常细胞的融合过程，细胞均匀分散的过程中，异常细胞相互间快速地融合。总之各组分相互有效地配合可以准确快速的观察样本是否有异性。

所述革兰氏染色液由以下重量份数的组分组成：结晶紫2~3份，草酸铵0.06~0.1份，蒸馏水500~600份，碘1~3份，碘化钾1~3份，乙醇120~150份，番红0.2~0.3份。

所述荧光探针的规格均为20人份，每组荧光探针的数量均为1管。所述荧光探针的3’号位均标记为橙色，所述荧光探针的5’号位均标记为绿色。所述复染液的规格为3只1ml。

一种基于所述亚型ph-likeall的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1）对样本进行肝素化处理制成骨髓涂片，将骨髓涂片进行预处理，制成涂片；2）将荧光探针用水溶解，并加入杂交液，得到探针溶液；3）将探针溶液滴加到涂片的杂交区域，进行变性杂交；4）滴加复染液到涂片的杂交区域，扫描并观察结果。添加复染液可以准确地观察到样本是否有异性，fish正常细胞显示为2橙色、2绿色，fish异常细胞显示1橙色、1绿色和一橙绿融合。

优选地，所述肝素化处理采用下列重量份数制成的涂层液：肝素5~10份，聚氨酯70~80份，羟丙基纤维素3~7份，水80~100份。采用该配方的涂层液，无毒，生物相容性好，使用中对细胞影响小，无细胞毒性；肝素溶于水，避免有机溶剂，降低成本；羟丙基纤维素亦可溶于水，促进样本均匀快速的肝素化。

进一步优选地，所述肝素化处理方法为：加热所述涂层液到40~50℃，然后真空条件下向样本喷涂。

优选地，所述步骤1）还可以对样本滴加edta—醋酸钠制成骨髓涂片。

优选地，所述杂交液由以下重量份数的物质组成：十二烷基磺酸钠5~10份，柠檬酸缓冲液20~50份，尿素30~50份。

优选地，所述骨髓涂片的预处理包括如下步骤：a）将涂片60~70℃预热5~10min，用浸蜡脱蜡透明液脱蜡2次每次10~20min，用无水乙醇脱水2次每次3~5min；所述浸蜡脱蜡透明液为异构烷烃型；b）依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度复水，各0.5~2min，吸去残余溶液；c）放在已经预热到75~85℃的预处理液中保温20~40min，取出在纯化水中浸泡1~2min，吸去残余溶液；d）取40~60mg胃蛋白酶干粉溶解在已预热至36~38℃的酶缓冲液中，浸入消化20~30min；e）在纯化水中浸泡1~2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度脱水，各0.5~2min，干燥备用。所述步骤c）中所述预处理液为0.9~1.1mol/l的硫氰酸钠溶液。所述酶缓冲液为0.01mol/l的稀盐酸，室温下的ph值为2.0±0.2。

本发明的有益效果是：

1)本试剂盒检测囊括了目前已知的所有针对性用药的ph-likeall类型，经探针溶液与样本变性杂交后，滴加复染液，能够全面准确地检测ph-likeall；

2)荧光探针具有很强的特异性，只结合特定位点的染色体，特异性强；

3)采用荧光原位杂交技术，荧光信号在显微镜下一目了然，灵敏度很高；

4)该检测试剂盒具有简单、快速、成本低、灵敏度高、特异性强、检测全面等优点，获得骨髓细胞后可迅速处理成涂片，一般可在2-5天内出结果；

5)使用该试剂盒进行全面的检测，可以为临床指导用药提供有利依据。

附图说明

图1为fish正常细胞示意图，1、橙色，2、绿色。

图2为fish异常细胞，1、橙色，2、绿色，3、融合。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。

以下所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明要求的保护范围之内。

实施例一

一种亚型ph-likeall的检测试剂盒，包括12组荧光探针和复染液；12组所述荧光探针分别为abl1，abl2，csf1r，pdgfrb，crlf2，jak2，epor，il2rb，ntrk3，ptk2b，tslp和tyk2；所述复染液由以下重量份数的组分组成：革兰氏染色液5份，生理盐水1份，纤维素0.2份，荧光素0.5份，磷酸一铵0.1份。

一种基于上述亚型ph-likeall的检测试剂盒的检测方法，包括下列步骤：

1）对样本进行肝素化处理制成骨髓涂片，将骨髓涂片进行预处理，制成涂片；所述肝素化处理方法为：加热所述涂层液到40℃，然后真空条件下向样本喷涂；所述肝素化处理采用下列重量份数制成的涂层液：肝素5份，聚氨酯70份，羟丙基纤维素3份，水80份；所述涂层液的剂量为20u/kg。

2）将荧光探针用水溶解，并加入杂交液，得到探针溶液；所述杂交液由以下重量份数的物质组成：十二烷基磺酸钠5份，柠檬酸缓冲液20份，尿素30份；

3）将探针溶液滴加到涂片的杂交区域，进行变性杂交；

4）滴加复染液到涂片的杂交区域，盖上盖玻片，置-25℃暗处复染30分钟，扫描并观察结果。

使用物镜对样本进行扫描，确定样本是否有异质性。fish正常细胞显示为2橙色、2绿色，fish异常细胞显示1橙色、1绿色和1橙绿融合。

所述骨髓涂片的预处理包括如下步骤：

1）60℃预热10min，用浸蜡脱蜡透明液脱蜡2次每次20min，用无水乙醇脱水2次每次5min，所述浸蜡脱蜡透明液为异构烷烃型；

2）依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度复水，各2min，吸去残余溶液；

3）放在已经预热到75℃的预处理液中保温40min，取出在纯化水中浸泡2min，吸去残余溶液；所述预处理液为0.9mol/l的硫氰酸钠溶液；

4）取40mg胃蛋白酶干粉溶解在已预热至36℃的酶缓冲液中，浸入消化20min；所述酶缓冲液为0.01mol/l的稀盐酸，室温下的ph值为2；

5）在纯化水中浸泡2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度脱水，各2min，干燥备用。

实施例二

一种亚型ph-likeall的检测试剂盒，包括12组荧光探针和复染液；12组所述荧光探针分别为abl1，abl2，csf1r，pdgfrb，crlf2，jak2，epor，il2rb，ntrk3，ptk2b，tslp和tyk2；所述复染液由以下重量份数的组分组成：革兰氏染色液7份，生理盐水3份，纤维素0.6份，荧光素0.7份，磷酸一铵0.3份。

一种基于上述亚型ph-likeall的检测试剂盒的检测方法，包括下列步骤：

1）对样本进行肝素化处理制成骨髓涂片，将骨髓涂片进行预处理，制成涂片；所述肝素化处理方法为：加热所述涂层液到50℃，然后真空条件下向样本喷涂；所述肝素化处理采用下列重量份数制成的涂层液：肝素10份，聚氨酯80份，羟丙基纤维素7份，水100份；所述涂层液的剂量为40u/kg。

2）将荧光探针用水溶解，并加入杂交液，得到探针溶液；所述杂交液由以下重量份数的物质组成：十二烷基磺酸钠10份，柠檬酸缓冲液50份，尿素50份；

3）将探针溶液滴加到涂片的杂交区域，进行变性杂交；

4）滴加复染液到涂片的杂交区域，盖上盖玻片，置-15℃暗处复染40分钟，扫描并观察结果。

使用物镜对样本进行扫描，确定样本是否有异质性。fish正常细胞显示为2橙色、2绿色，fish异常细胞显示1橙色、1绿色和1橙绿融合。

所述骨髓涂片的预处理包括如下步骤：

1）70℃预热5min，用浸蜡脱蜡透明液脱蜡2次每次15min，用无水乙醇脱水2次每次5min，所述浸蜡脱蜡透明液为异构烷烃型；

2）依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度复水，各1min，吸去残余溶液；

3）放在已经预热到85℃的预处理液中保温20min，取出在纯化水中浸泡2min，吸去残余溶液；所述预处理液为1.1mol/l的硫氰酸钠溶液；

4）取60mg胃蛋白酶干粉溶解在已预热至38℃的酶缓冲液中，浸入消化30min；所述酶缓冲液为0.01mol/l的稀盐酸，室温下的ph值为2.2；

5）在纯化水中浸泡2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度脱水，各2min，干燥备用。

实施例三

一种亚型ph-likeall的检测试剂盒，包括12组荧光探针和复染液；12组所述荧光探针分别为abl1，abl2，csf1r，pdgfrb，crlf2，jak2，epor，il2rb，ntrk3，ptk2b，tslp和tyk2；所述复染液由以下重量份数的组分组成：革兰氏染色液6份，生理盐水2份，纤维素0.4份，荧光素0.6份，磷酸一铵0.2份。

一种基于上述亚型ph-likeall的检测试剂盒的检测方法，包括下列步骤：

1）对样本进行肝素化处理制成骨髓涂片，将骨髓涂片进行预处理，制成涂片；所述肝素化处理方法为：加热所述涂层液到45℃，然后真空条件下向样本喷涂；所述肝素化处理采用下列重量份数制成的涂层液：肝素8份，聚氨酯75份，羟丙基纤维素5份，水90份；所述涂层液的剂量为30u/kg。

2）将荧光探针用水溶解，并加入杂交液，得到探针溶液；所述杂交液由以下重量份数的物质组成：十二烷基磺酸钠8份，柠檬酸缓冲液35份，尿素40份；

3）将探针溶液滴加到涂片的杂交区域，进行变性杂交；

4）滴加复染液到涂片的杂交区域，盖上盖玻片，置-20℃暗处复染30分钟，扫描并观察结果。

使用物镜对样本进行扫描，确定样本是否有异质性。fish正常细胞显示为2橙色、2绿色，fish异常细胞显示1橙色、1绿色和1橙绿融合。

所述骨髓涂片的预处理包括如下步骤：

1）65℃预热8min，用浸蜡脱蜡透明液脱蜡2次每次15min，用无水乙醇脱水2次每次4min，所述浸蜡脱蜡透明液为异构烷烃型；

2）依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度复水，各1min，吸去残余溶液；

3）放在已经预热到80℃的预处理液中保温30min，取出在纯化水中浸泡2min，吸去残余溶液；所述预处理液为1mol/l的硫氰酸钠溶液；

4）取50mg胃蛋白酶干粉溶解在已预热至37℃的酶缓冲液中，浸入消化25min；所述酶缓冲液为0.01mol/l的稀盐酸，室温下的ph值为2.0；

5）在纯化水中浸泡2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度脱水，各1min，干燥备用。

实施例四

一种亚型ph-likeall的检测试剂盒，包括12组荧光探针和复染液；12组所述荧光探针分别为abl1，abl2，csf1r，pdgfrb，crlf2，jak2，epor，il2rb，ntrk3，ptk2b，tslp和tyk2；所述复染液由以下重量份数的组分组成：革兰氏染色液6份，生理盐水2份，纤维素0.4份，荧光素0.6份，磷酸一铵0.2份。

一种基于上述亚型ph-likeall的检测试剂盒的检测方法，包括下列步骤：

1）对样本edta—醋酸钠制成骨髓涂片，将骨髓涂片进行预处理，制成涂片；所述肝素化处理方法为：加热所述涂层液到45℃，然后真空条件下向样本喷涂；所述肝素化处理采用下列重量份数制成的涂层液：肝素8份，聚氨酯75份，羟丙基纤维素5份，水90份；所述涂层液的剂量为30u/kg。

2）将荧光探针用水溶解，并加入杂交液，得到探针溶液；所述杂交液由以下重量份数的物质组成：十二烷基磺酸钠8份，柠檬酸缓冲液35份，尿素40份；

3）将探针溶液滴加到涂片的杂交区域，进行变性杂交；

4）滴加复染液到涂片的杂交区域，盖上盖玻片，置-20℃暗处复染40分钟，扫描并观察结果。

使用物镜对样本进行扫描，确定样本是否有异质性。fish正常细胞显示为2橙色、2绿色，fish异常细胞显示1橙色、1绿色和1橙绿融合。

所述骨髓涂片的预处理包括如下步骤：

1）65℃预热8min，用浸蜡脱蜡透明液脱蜡2次每次15min，用无水乙醇脱水2次每次4min，所述浸蜡脱蜡透明液为异构烷烃型；

2）依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度复水，各1min，吸去残余溶液；

3）放在已经预热到80℃的预处理液中保温30min，取出在纯化水中浸泡1min，吸去残余溶液；所述预处理液为1mol/l的硫氰酸钠溶液；

4）取50mg胃蛋白酶干粉溶解在已预热至37℃的酶缓冲液中，浸入消化25min；所述酶缓冲液为0.01mol/l的稀盐酸，室温下的ph值为2.0；

5）在纯化水中浸泡2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、纯化水中梯度脱水，各1min，干燥备用。