一种靶向肿瘤干细胞标志物CD133的多肽及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学检测和药物化学领域，具体涉及肿瘤干细胞cd133特异性靶向多肽筛选及其作为药物载体的应用。
背景技术：
：恶性肿瘤是严重危及人类生命的疾病之一，近几十年来，世界范围内肿瘤的发病率和病死率越来越高。现在对于多数恶性肿瘤可以采用手术、化疗与放射、靶向和免疫治疗等方法能够杀灭大部分肿瘤细胞，但绝大多数肿瘤患者仍无法获得根治，容易复发和转移，恶性肿瘤患者的生存时间和生活质量始终较低。2001年，肿瘤干细胞(cancerstemcell，csc)这一概念被正式提出。肿瘤干细胞(csc)假说认为肿瘤组织中存在极少量的瘤细胞充当着干细胞的角色，它们具有自我更新能力、无限增殖能力和高致瘤性等特点，使得肿瘤组织中具有自我更新能力的肿瘤细胞的数量不断增加，肿瘤组织能够不断增大且能驱动肿瘤的形成和生长。除此之外，csc还有以下特性，比如还(1)具有抗凋亡特性，csc高度表达抗凋亡基因bcl-2；(2)具有端粒酶活性；(3)耐药性,csc膜表面表达多种abc转运蛋白，可以利用atp水解提供的能量把药物泵出细胞外。由此可见，对肿瘤干细胞展开深入研究确实对于推进肿瘤防治有至关重要的意义。因此，消除cscs是具有挑战性的，但它是成功根除肿瘤所必需的。尽管csc的发现使人们对肿瘤有了进一步的认识，但距离彻底治愈肿瘤还是有很长的路要走。然而，由于缺乏检测，定位和非侵入性的量化检测技术，阻碍了csc在临床患者中的调查研究。具体来说，还没有报道用临床相关的成像探针(例如，结合csc特异性细胞表面蛋白的抗体或其他配体)对csc成功进行非侵入性的成像操作。癌干细胞(cscs)被认为是对许多恶性肿瘤的生长和传播以及治疗后的复发的负责。因此，csc的无创成像方法可能对肿瘤诊断和治疗监测产生深远的影响。但是，临床仍然缺乏可用于非侵入性csc成像的方法。因此，当前的工作应着重于发展多种测定方法对尽可能多的csc进行有效分析，并对其靶向治疗，对目前肿瘤的诊断、预防和治疗可能会具有重要的意义。寻找特异性的表面标记物，通过其分选肿瘤干细胞，是进一步研究肿瘤发生、转移、复发和预后的关键。因此，肿瘤治疗应当针对肿瘤干细胞，通过特异表面标记分选肿瘤干细胞是研究其生长特点的前提。cd133也称为prominin-1，是高度糖基化的五次跨膜膜糖蛋白，其与质膜中的胆固醇结合。人cd133基因位于4号染色体，包含至少37个外显子。cd133蛋白为细胞膜蛋白超家族成员，含有865个氨基酸、分子量约为120kd的糖蛋白。其分子结构包括：细胞外nh2-端，2个大的胞外环状结构，5次跨膜结构域，2个小的富含半胱氨酸胞内环状结构和胞内的-cooh结构(zhangetal,chinesejournalofcancer,2010,29,3)。cd133是人类干/祖细胞膜上发现的一种跨膜糖蛋白抗原，常表达于神经原始细胞、上皮/内皮祖细胞谱系、造血干/祖细胞等，是目前用来标记或分选干/祖细胞的最常用的膜表面标志。越来越多的证据表明cd133已经成为众多肿瘤干细胞表面的特异标记分子，cd133蛋白不仅仅在神经干细胞、表皮干细胞等干细胞中有表达，在白血病干细胞、大肠癌干细胞、脑肿瘤干细胞等多种肿瘤干细胞中都有表达。研究表明，cd133强表达的肝癌患者生存期明显较cd133弱表达组的短，cd133的表达与hcc患者的总生存期相关，细胞质表达cd133是影响hcc患者总生存的非常显著的危险因素。检测肝癌患者外周血cd133表达，分析其与临床病理特征、肿瘤远端转移等的相互关系，具有重要的临床意义。cd133+肿瘤细胞与肿瘤的自我更新、分化潜能、信号传导调控、药物耐受、复发和预后等均有相关性。cd133+细胞有望在干细胞相关疾病的治疗和肿瘤靶向治疗中发挥巨大作用。cd133作为多种肿瘤共同的细胞表面标志物，通过cd133特异性分选干细胞，将更有助于我们研究肿瘤干细胞的生物学特性、信号传导通路和耐放化疗机制。同时，将有可能以cd133作为靶向治疗肿瘤的靶点，为肿瘤治疗带来重大突破。脂质体(liposome)是一种人工生物膜，其在水中亲水头部会进入水中，疏水尾部会伸向空气中，并通过搅动后会形成具有双层磷脂分子的球形。脂质体对细胞膜亲和性好，作为药物的载体具有靶向、高效、缓释、副作用小等特点，已被广泛应用于医药领域。脂质体作为药物的载体，能达到药物制剂在治疗上的很多要求，拥有很多优点。但普通脂质体作为药物载体主要是通过被动靶向将药物运输到病灶部位。为了减少药物用量，提高治疗效果，主动靶向的给药方法成为研究的热点。将小分子多肽修饰到脂质体表面，能够增强脂质体颗粒的肿瘤靶向性，增强肿瘤药物的定向运输，对增强肿瘤治疗效果具有重要的研究意义。基于纳米技术的药物递送系统可以克服传统化疗药物稳定性差、特异性低和毒性高等缺点，其独特的尺寸效应可将纳米药物载体负载的化疗药物通过高通透性和滞留效应效应在肿瘤组织富集。因此，构建肿瘤靶向递药系统，降低化疗药物对正常器官的损害，增强化疗药物在肿瘤实质中的渗透性越来越引起研究者的关注。肿瘤干细胞被认为在肿瘤维持，转移，肿瘤治疗中起关键作用抵抗和复发。因此，有必要开发非侵入性体内检测癌症干细胞的方法实现对csc的动态监测。然而，csc通常只能构成肿瘤细胞的一小部分，存在数量极少，很难被发现和捕获。分子影像在免疫治疗和个性化医学中发挥越来越重要的作用。其中分子探针的制备是分子影像的关键，只有高灵敏度和特异性的分子探针引入体内后可与细胞内特定的靶分子发生特异性结合并产生某种信号，体外通过特定的影像设备，如：正电子发射计算机断层扫描(pet-ct)、单光子发射计算机断层成像术(spect)、磁共振成像(mri)以及化学发光设备等进行采集成像，从而达到特异性诊断的才能实现高度特异性的诊断。因此，急需开发高灵敏度和高特异的分子探针。当前的用于检测和靶向cd133阳性癌症干细胞的组织病理学技术是基于抗cd133抗体。使用临床相关示踪剂观察肿瘤干细胞的技术可能对癌症诊断和治疗有广泛的影响，cd133目前是许多颅内和颅外实体肿瘤表现最好的肿瘤干细胞标记之一(gaedickeetal,pnas,2014,111(6),e692)。尽管最近有一些关于使用单克隆抗体对csc标记物表达肿瘤细胞进行成像和治疗靶向的报道，但迄今为止还没有报道关于csc或表达csc标记物的靶向多肽用于肿瘤的非侵入性体内成像和靶向治疗。但由于抗体药物存在着制备繁琐、体外稳定性较差、分子较大、标记困难、穿透力弱，翻译后修饰且费用昂贵等原因使其进一步应用受到限制。因此，为了提高癌症诊断和治疗的特异性和准确性，弥补抗体的缺陷，迫切需要寻求针对新的肿瘤标志物设计小分子探针，以作为检测和治疗癌症的有效方法。多肽类靶向小分子药物及诊断探针以成本低、分子量小、生物相容性好、穿透性强、无免疫原性、并有较快的血液清除速率、且制备简单等特点，在肿瘤靶向给药、癌症诊断等方面彰显出很强的优越性。因此，开发一种针对cd133的多肽探针对多种肿瘤干细胞的诊断将有突破性的重大意义。技术实现要素：本发明涉及一种肿瘤干细胞标志物cd133的靶向多肽筛选及该多肽和化疗药物联合的载药脂质体的应用。本发明的主要目的是针对现有技术存在的不足提供了一种靶向cd133的多肽用于检测和靶向肿瘤干细胞，该多肽和化疗药物联用，制备成cd133多肽-聚乙二醇化磷脂复合物-化疗药物载药脂质体，利用cd133多肽提高药物对肿瘤组织的靶向渗透能力。本发明为实时监控患者外周血cd133表达和cd133+肿瘤干细胞在肿瘤复发、转移、药物耐受和预后的相关性提供了简便快捷、经济、准确的检测手段，以便及时调整治疗方案，改善患者预后提供了新的手段。所述多肽不仅特异性、敏感性好，并且制备方法简单，成本低，具有很强的实用性。为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种靶向肿瘤干细胞标志物cd133的多肽，该多肽能与cd133蛋白相结合，所述多肽的通式为：cx1x2x3x4x5x6x7x8lx9其中，c半胱氨酸，l为亮氨酸，x1是芳香族氨基酸，优选为酪氨酸或色氨酸；x2是非极性氨基酸，优选为异亮氨酸和精氨酸；x3是非极性氨基酸，优选为缬氨酸或亮氨酸；x4是非极性氨基酸，优选为精氨酸或苯丙氨酸；x5是芳香族氨基酸，优选为酪氨酸或色氨酸；x6是碱性或酸性氨基酸，优选为赖氨酸或天冬氨酸；x7是极性氨基酸，优选为苏氨酸和丝氨酸；x8中性氨基酸，优选为脯氨酸和天冬酰胺；x9是碱性或酸性氨基酸，优选为赖氨酸和谷氨酸。本发明所述的氨基酸残基可以是l-型，也可以是d-型，或者是l-、d-型的混合。本发明中，根据yin等人(blood,1997,90(12):5002)的报道基于人cd133的蛋白结构特点和分子识别理论进行肽库的设计和构建。采用氨基修饰的tentagel树脂作为固相载体，利用fmoc合成策略进行混合均分合成库容量为106的一珠一物肽库。利用荧光标记磁球和微流控芯片的方法进行高通量一珠一物肽库筛选，阳性肽珠经maldi-tof-ms鉴定，获得了一系列能特异性结合cd133的活性多肽。作为优选技术方案，本发明所述多肽的氨基酸序列如下表cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一所示，其分别对应序列表中的序列1、2、3所示的氨基酸序列。多肽的氨基酸序列：seqidcs133-p1cyivfydspleseqidcs133-p2cwrlrwhsplkseqidcs133-p3cwdvqyktnle本发明中，所述cs133-p1、cs133-p2和cs133-p3所示的氨基酸序列对cd133高特异性亲和。第二方面，本发明还提供了一种dna片段，其包含编码上述本发明第一方面所述多肽的氨基酸序列。作为优选技术方案，所述dna片段包含编码本发明上述cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一的氨基酸序列。第三方面，本发明还提供了一种表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为本发明第一方面所述多肽的如本发明第二方面所述的dna片段。作为优选技术方案，本发明的表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为cs133-p1、cs133-p2cs133-p3之一所示多肽的如本发明第二方面所述的dna片段。第四方面，本发明还提供了一种原核或真核宿主细胞，该宿主细胞含有如本发明第三方面所述的表达载体。第五方面，本发明还提供了一种二价体或多价体，由本发明第一方面所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一)组装而成。本发明中的二价体或多价体具有靶向cd133阳性的肿瘤干细胞的特性。作为优选技术方案，本发明的二价体或多价体是通过连接分子共价连接形成；或是通过与多聚体混合、非共价连接形成的。优选地，所述的连接分子为6-叔丁氧羰肼基烟酸(hynic)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(edc)或n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)；该连接分子是一种新型无毒、生物相容性良好的交联剂。本发明可以根据具体需要来选择多聚体，例如可以是聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子(pamam)、聚乳酸(pla)、聚乳酸-乙醇胺(plga)中的任意一种或至少两种的混合。第六方面，本发明还提供了一种药物组合物，包括本发明第一方面所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2或cs133-p3)或本发明第五方面所述的二价体或多价体作为靶向多肽；以及能杀伤癌细胞的制剂。进一步地，所述药物组合物还包括与所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一)或所述二价体或多价体相缀合或混合可制备靶向药物的载体。优选地，所述制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物；或包裹这些药物的载体中的任意一种。进一步优选地，所述制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。进一步优选地，所述载体为纳米材料、脂质体或聚合物胶束中的任意一种。本发明采用将第一方面所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一)或第五方面所述的二价体或多价体与所述载体(纳米材料、脂质体或聚合物胶束等高分子材料)缀合，本发明所述的多肽、二价体或多价体可以使缀合后生成的化合物在机体内更稳定地被运输到靶细胞。第七方面，本发明还提供了另外一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一)或本发明第五方面所述的二价体或多价体，以及显像制剂。优选地，所述多肽、二价体或多价体与显像制剂相缀合或混合。优选地，所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种。第八方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一)或本发明第五方面所述的二价体或多价体在制备用于治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的用途。作为优选技术方案，本发明所述癌症为cd133过表达的癌症。优选地，所述癌症为神经胶质瘤、肝癌、非小细胞肺癌、白血病、肾癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌等。本发明的肽具有靶向cd133蛋白的作用，可以作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在cd133阳性干细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向肿瘤干细胞的抗癌药物。本发明多肽和化疗药物联用，制备成肿瘤靶向性多肽-聚乙二醇化磷脂复合物-化疗药物载药脂质体，利用cd133多肽提高了药物对肿瘤组织的靶向渗透能力。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明的多肽具有靶向cd133阳性肿瘤细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的多肽作为分子探针用于非侵入性的影像学技术检测肿瘤干细胞的数量和活性预测评估接受治疗的病人耐药反应和疗效评估。本发明的多肽探针选择性强，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠，可以采用化学合成的方法制备，简单易行，适于作为化疗的预测和伴随诊断试剂。本发明药物组合物用于近红外荧光成像在皮移植肿瘤中对cd133肿瘤干细胞进行高灵敏度、高分辨率监测和靶向治疗。本发明为实时监控患者外周血cd133表达和cd133肿瘤干细胞在肿瘤复发、转移、药物耐受和预后的相关性提供了简便快捷、经济、准确的检测手段，以便及时调整治疗方案，改善患者预后提供了新的手段。(2)本发明的针对cd133的靶向多肽是目前最为普适的一类肿瘤靶向多肽，还没有相关的报道。因此，本发明对csc测定方法进行有效的补充，并对其靶向治疗，对目前肿瘤的诊断、预防和治疗可能会具有重要的意义。(3)cd133多肽介导的靶向纳米载体相比抗体用于肿瘤诊疗具有独特优势。多肽作为天然的优良两亲性分子，可通过特定的序列设计来自组装形成规整有序的纳米结构。多肽功能化的纳米载体可以通过共价或非共价的形式输运诊断探针及抗肿瘤药物。因其良好的生物相容性、易降解、可调的机械性能以及环境响应性，在肿瘤诊疗领域具有很强的实用性备受关注。(4)本发明中，cd133多肽筛选方法采用既具有高荧光量子效率，又具有聚集诱导发光(aie)性能的tpe分子，在聚集后可提高分子的抗光漂白能力，普通的荧光分子容易产生分子聚集荧光猝灭。此外，只有通过识别-聚集-发光的途径，荧光才特异“打开”而被检测到，可以消除非特异性吸附的荧光干扰，进而提高筛选的效率和减少假阳性率。附图说明图1cd133靶向多肽微芯片筛选图；图2表面等离子共振(spri)检测阳性多肽与人cd133蛋白的亲合力；图3cs133-p2多肽对cd133+肿瘤干细胞以及结直肠癌病人组织切片的特异性染色；图4肿瘤细胞对cs133-p2-lp脂质体药物载体的摄取情况；图5cs133-p2-lp药物载体的体外抗肿瘤检测。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实验例1本发明cd133靶向多肽筛选系统的构建和筛选1)实验仪器与材料n-甲基吗啉(nmm)，哌啶，三氟乙酸(tfa)，二氯甲烷(dcm)，茚三酮，维生素c，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(tis)，乙二硫醇(edt)，n,n二甲基甲酰胺(dmf)，无水乙醚，树脂，甲醇，各种fmoc保护氨基酸，四苯基乙烯(tpe)，pe-anti-cd133抗体，mb-streptavidin(链霉亲和素磁珠)，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，激光共聚焦显微镜(zeisslsm710)，上述试剂和材料均从商业途径获得。2)cd133“一珠一物”多肽文库的合成采用fmoc固相肽合成方法合成多肽文库，具体方法如下：称取200mg的tentagel-nh2树脂，按照上述固相多肽合成程序循环，依次加入met、gly依次进行反应，脱保护后进行混合均分合成；(1)待反应完成后，把树脂均分4份，向每管分别加入thr、glu、lys、arg与等量的hbtu进行偶联，待偶联完毕后，把4管树脂脱保护后混合，再把树脂相应均分为若干份，依次循环合成；(2)分别加入tyr、leu偶联方法同(2)；(3)分别加入asp、asn、arg、pro、his偶联方法同(2)；(4)分别加入thr、ser、tyr、pro偶联方法同(2)；(5)分别加入glu、lys、ser、his、asp偶联方法同(2)；(6)分别加入tyr、phe、trp偶联方法同(2)；(7)分别加入gln、tyr、phe、arg、glu偶联方法同(2)；(8)分别加入pro、leu、lys、val、asp偶联方法同(2)；(9)分别加入asp、asn、arg、ile、his偶联方法同(2)；(11)分别加入tyr、trp偶联方法同(2)；(12)分别加入cys偶联方法同(2)，待偶联完毕后，树脂tfa脱保护后混合。经过甲醇置换和收缩步骤，真空抽干，得到加载有肽库的干燥树脂备用。3)cd133阳性多肽的筛选(1)取干燥肽库用1×pbs洗3次，加入5％的脱脂牛奶在混旋仪上37℃对肽珠表面封闭2h，再用1×pbs洗3次；(2)取四苯基乙烯(tetraphenylethene,tpe)和生物素标记的cd133蛋白与多肽库混合，37℃孵育2h后用1×pbs洗3次；(3)然后分别取100μlmb-streptavidin加入肽库在混旋仪上37℃避光混合孵育2h。把孵育后含多肽库ep管置于磁力架上。阳性多肽受磁力影响吸附于ep管侧壁，而阴性多肽由于重力沉降在ep管底。由图(1)看出阳性肽珠与tpe标记的受体蛋白孵育后，阳性肽珠特异性识别蛋白，标记tpe和磁性链霉亲和素通过识别生物素而识别阳性肽珠。阳性肽珠表面将包覆一层磁珠具有磁性从而被磁场捕获同时由于蛋白结合引起tpe的聚集诱导发光特性(aie)阳性多肽珠子产生蓝色荧光。同时，亲和力越强聚集的荧光越强，可直观的找到最好的阳性肽。将阳性肽珠转移到微芯片阵列中，滴加溴化氢原位裂解，用maldi-tof-ms鉴定通过mascot数据库解出相应序列信息。按序列重新合成阳性多肽部分标记荧光，maldi-tof鉴定和hplc纯化用于后续试验。经化学合成制得本发明的3条多肽分别为：cs133-p1、cs133-p2和cs133-p3。实验例2通过表面等离子共振(spri)方法检测cs133-p2多肽与cd133蛋白的亲和作用将1mg/ml的cs133-p2多肽及1×pbs点到芯片上，在4℃湿润条件下孵育过夜，然后用10×pbs清洗10min，再用1×pbs清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，浸入含5％牛奶的1×pbs中，4℃条件下孵育过夜，然后用10×pbs清洗10min，1×pbs清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，用氮气吹干，装芯片上机(plexeraht表面等离子共振成像系统)。流动相依次通过1×pbs、2×pbs、0.78μg/ml、1.56μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml和25μg/ml的人cd133纯化蛋白，记录分析spri信号。由图2可以看出，cs133-p2的spri信号随着蛋白浓度的增加逐渐增强，说明本发明的cs133-p2多肽对cd133都有强结合的，而且亲和解离常数达到7.37×10-9m，接近抗体的亲和力。可以作为探针靶向cd133的肿瘤干细胞，用于相关的检测研究和靶向治疗应用。实验例3cs133-p2分别与白血病中分离的cd133+肿瘤干细胞以及结直肠癌病人组织切片的特异性染色经cd133抗体流式分选cd133+肿瘤干细胞用含细胞生长因子的干细胞完全培养基37℃培养24h后，以1×103/ml的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(35mm)，三种细胞中分别加入含1μmol/lhoechst33342和5μlpe-anti-cd133抗体，4℃避光孵育60min后，用预冷1×pbs洗涤2次，分别加入50μmol/l的fitc标记cs133-p2多肽，4℃避光孵育20min后，用预冷1×pbs洗涤3次。用激光扫描共聚焦显微镜(zeisslsm710)检测干细胞中的荧光分布。肿瘤组织样本用多聚甲醛固定48h以上(中途更换一次多聚甲醛)，并制作石蜡切片，脱蜡后，先进行cd133抗体免疫组化染色，再用fitc标记cs133-p2多肽染色，方法参照h&e染色，然后显微镜观察。结果如图3(a)所示，加入cs133-p2干细胞观测到有很强绿色荧光，同时pe标记的cd133抗体也可特异的结合干细胞，图3(b)切片染色也显示，cs133-p2多肽结合在肿瘤组织中阳性肿瘤干细胞的细胞膜上，抗体定位显示与cd133表达部位相同。即cs133-p2多肽可特异的识别结合cd133阳性肿瘤干细胞，而且特异性与靶标蛋白的表达量呈正相关，可以作为靶向分子替代抗体用于cd133阳性相关干细胞的诊断和检测。实验例4在本实施例中，评价cs133-p2-lp药物载体的体外抗肿瘤效果，具体方法如下：(1)纳米脂质体的制备：称取大豆软磷脂、胆固醇、阿霉素(dox)、多肽偶联物(cs133-p2-peg2000-dspe)，比例为8:2:1:1(w/w/w/w)。将上述称取样品溶解在甲醇/二氯甲烷(v/v2:1)的混合溶液里置于圆底烧瓶中旋转蒸发形成均匀的薄膜后，1×pbs于60℃水浴震荡水化20min。然后超声15min。最后经过220nm的滤膜过滤得到所需的脂质体药物载体。(2)人结直肠癌细胞系ht29(cd133阳性)和人肾上皮细胞系293t细胞(cd133阴性)用含10％胎牛血清及1％青霉素和链霉素的dmem/highglucose培养基在37℃恒温培养箱(5％co2)中培养。(3)以1×105/ml的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(35mm)细胞贴壁后，去掉培养基，然后分别加入lp，cs133-p2-lp(20μg/ml,200μl)样品溶液，37℃孵育2h。加pbs清洗后，然后加入溶酶体标记染料(lysotrackergreen,50nm)和细胞核染料(hoechst33342,10nm)孵育30min。最终，pbs洗三次后，加入少量的pbs。激光共聚焦显微镜下观察细胞对于纳米脂质体的摄取情况。(4)将ht29和293t以每皿5×103个细胞的数量接种到96孔板中进行过夜培养24h。然后一组96孔板中每个孔里加入200μl不同浓度的游离dox，lp，cs133-p2-lp的样品溶液(浓度分别为0.01，0.05，0.1，0.2，0.4和0.8mg/ml)，孵育24h。吸掉药物溶液，加入0.5mg/ml的mtt溶液37℃度孵育4个小时。吸掉液体，加入200μl二甲基亚砜(dmso)，经过10分钟震荡混匀后，使用酶标仪测定570nm处的光密度od570值，并分析细胞药物毒性。从图4a中我们可以看到cs133-p2-lp在ht29细胞中dox荧光强度显著高于其他组，而且在细胞核有大量的聚集。反之，对照组lp在细胞质中显示出的荧光也非常弱(图4b)，这表明没有靶向肽识别元件的情况下，脂质体对细胞膜的结合能力不强。此外，cs133-p2-lp处理的阴性细胞系293t细胞显示非常弱的荧光强度，表明cs133-p2-lp在缺乏靶向受体的细胞中的细胞摄取并不明显(图4c)。根据上述结果发现，在细胞膜靶向元件(cs133-p2)的辅助下，脂质体以特异和有效的方式进入细胞质和相应的亚细胞结构。在细胞水平上验证cd133靶向脂质体的靶向性，因此cs133-p2-lp可以作为一个有效靶向cd133阳性肿瘤干细胞的药物载体。为了进一步评估脂质体药物载体对肿瘤细胞的杀伤效果，通过mtt方法来监测细胞存活率。如图5a所示，cs133-p2-lp对cd133阳性的肿瘤细胞ht29的细胞毒性随脂质体浓度的增加而增加，且与没有多肽修饰的非靶向脂质体相比具有更强的细胞毒作用。如图5b所示，cs133-p2-lp对cd133阴性细胞293t表现出很低的细胞毒性进而说明其安全性。这一结果表明cd133多肽修饰脂质体能够提高cd133阳性肿瘤对药物的摄取导致更高效的细胞毒作用杀灭肿瘤。综上所述，从实验例1-4可以得出，本发明的多肽具有靶向表达cd133阳性肿瘤细胞和肿瘤干细胞的特性，该药物递送载体在很大程度上减少了化疗药物用量，降低了药物毒副作用。在临床上对相关肿瘤具有诊断和治疗的应用价值。因而在实际应用中，可以将本发明的多肽作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于肿瘤的靶向治疗和成像，免疫治疗反应标志物的检测。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属
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的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>国家纳米科学中心<120>一种靶向肿瘤干细胞标志物cd133的多肽及其应用<130>khp171113669.5<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>11<212>prt<213>人工序列<400>1cystyrilevalphetyraspserproleuglu1510<210>2<211>11<212>prt<213>人工序列<400>2cystrpargleuargtrphisserproleulys1510<210>3<211>11<212>prt<213>人工序列<400>3cystrpaspvalglntyrlysthrasnleuglu1510当前第1页12