一种戊糖片球菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种戊糖片球菌及其应用。
背景技术：
：片球菌属拉丁学名为pediococcusclaussen，细胞球形且永不延长，直径1.2～2.0μm。在适宜条件下，分裂以水平垂直二个方向形成四联，有时也可出现成对排列，单个细胞罕见，不形成链状。革兰氏染色阳性，不运动，不产芽孢。兼性厌氧，有的菌株在有氧时会抑制生长。化能异养，细胞需要丰富营养的培养基，发酵糖类(主要是单糖和双糖类)。戊糖片球菌属于片球菌属，菌落圆形、乳白色、光滑、凸起、边缘整齐、不透明、革兰氏染色阳性。戊糖片球菌为美国食品药物管理局认为安全的40种益生菌之一。戊糖片球菌现已被广泛应用于多种传统发酵食品和饮料的生产中，常用于发酵豆奶等的研究。乳酸菌（lacticacidbacteria，lab）是一些能够发酵某些糖类产生乳酸的细菌的通俗称谓，并非细菌分类学上菌株分类定义。乳酸菌是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。按照伯杰细菌鉴定手册（第八版），工业上应用广泛的乳酸菌主要包括革兰氏阳性球菌中链球菌科中的链球菌属，明串珠菌属、片球菌属中的一部分菌种；革兰氏阳性不生芽孢的杆状细菌中乳杆菌科中的乳杆菌属；放线菌目中放线菌科中的双歧杆菌属。自然界中，在植物上能发现乳酸菌，但有些乳酸菌种尤其大量存在于牛乳中，其它乳酸菌见于动物肠道。在乳品工业中，常常将乳酸菌群分为两类：球菌和杆菌。在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。乳酸菌中除极少数外，绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的关系。发酵剂（starterculture）是指用于酸奶、酸牛乳酒、奶油、干酪、纳豆和其他发酵产品生产的细菌以及其他微生物的培养物。许多微生物都可以作为发酵剂使用，包括乳杆菌属、微球菌属、葡萄球菌属、片球菌属、链球菌属、乳球菌属和芽孢杆菌属的部分细菌，以及酵母菌、霉菌和放线菌的部分菌类都可作为发酵剂使用。牛乳中干物质含量约为12%，其他成分为水。与其他食品不同，牛乳中主要糖类为乳糖。乳糖是一种双糖，由一分子β-d-半乳糖和一分子α-d-葡萄糖在β-1，4-位形成糖苷键相连，微生物能否利用乳糖与其能够产生糖苷酶（如β-半乳糖苷酶）来降解乳糖有关。链球菌属中的嗜热链球菌与乳杆菌属中的保加利亚乳杆菌是酸奶中两种常规发酵剂菌种。在酸奶发酵初期杆菌生长缓慢，但其有微弱的蛋白质分解能力，可产生一定量的肽和氨基酸，对球菌的生长有刺激作用。当酸乳混合物的ph下降到5.5时，球菌的生长将被抑制，此时有利于杆菌的生长。然而对于生产者和消费者来说，越来越希望使用不同的发酵剂，从而产生与传统酸奶不同的营养和感官特性，因此各式各样的发酵乳应运而生，如cltura-ab（嗜酸乳杆菌和双歧杆菌），yakult（干酪乳杆菌），progurt（嗜酸乳杆菌，双歧双歧杆菌，乳酸乳球菌乳脂亚种以及乳酸乳球菌乳亚种丁二酮变种）等。戊糖片球菌（pediococcus.pentosaceus），革兰氏染色呈阳性、不运动、不产生孢子的球菌，直径0.8~1.0μm。营养要求复杂，一般要求有b族维生素和一些氨基酸。在mrs培养基中37℃培养2d后形成圆形菌落，乳白色，光滑，凸起，边缘整齐，不透明。戊糖片球菌在医药、保健食品、发酵肉制品、发酵乳、乳饮料、干酪中的工业应用值得期待。技术实现要素：本发明针对以上问题，提供一种戊糖片球菌及其应用。发明目的通过以下方案实现：一种戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036），于2017年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14218，具有优良的牛乳发酵性能，且风味好。进一步的，其菌落形态学特征为：圆形菌落，乳白色，光滑，微凸起，边缘整齐，不透明；其菌体形态特性为：革兰氏阳性，无芽孢形成，球形。进一步的，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）具有优良的牛乳发酵能力：在37℃-43℃下，利用牛乳中的乳糖进行发酵产生乳酸，造成ph降低使乳凝固，凝乳无异味。进一步的，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）具有优良的牛乳发酵能力：在12%灭菌全脂乳培养基中连续传代10次后，发酵能力稳定，仍能在37℃于12%灭菌全脂乳发酵12h产酸使乳凝固，凝乳无异味。进一步的，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）具有优良的牛乳发酵能力：利用高浓度（48%）的乳粉复原乳进行乳酸发酵：使乳凝固，凝乳无异味。进一步的，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）具有优良的牛乳发酵能力：在干酪生产中能加速成熟速度，促进蛋白分解以及风味形成。进一步的，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）制成的发酵乳产品风味优良，呈味物质含量高于普通酸奶，呈味物质包括2,3-戊二酮和3-羟基-2-丁酮。一种戊糖片球菌的应用，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）：发酵牛乳制成的高密度微生物纯培养物，可用于发酵乳、干酪等生产用的商业发酵剂。一种戊糖片球菌的应用，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）：供人摄取可肠道定植、调节肠道菌群、增强免疫力活性的微生物菌剂。一种戊糖片球菌的应用，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）：其他菌株做共生复配，按比例制成发酵剂应用于发酵乳、干酪、发酵肉、发酵果蔬汁、酸菜、泡菜发酵食品。本发明提供了一株戊糖片球菌，该菌可应用于发酵牛乳制成的高密度微生物纯培养物，添加或不添加保护剂，经过或不经过深冻，可用于发酵乳、干酪等生产用的商业发酵剂；供人摄取可肠道定植、调节肠道菌群、增强免疫力等活性的微生物菌剂；与其他菌株做共生复配，按一定比例制成发酵剂应用于发酵乳、干酪、发酵肉、发酵果蔬汁、酸菜、泡菜等发酵食品；制备具有一定生理调节作用的保健食品或药品。生物材料保藏本发明所提供的戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）于2017年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14218，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。说明书附图图1高浓度全脂复原牛乳发酵乳滴定酸度实验图。图2不同菌种发酵剂的干酪成熟时间比对实验图。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作进一步说明：实施例1，本发明的一种戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036），于2017年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14218，具有优良的牛乳发酵性能，且风味好。一种戊糖片球菌，其菌落形态学特征为：圆形菌落，乳白色，光滑，微凸起，边缘整齐，不透明；其菌体形态特性为：革兰氏阳性，无芽孢形成，球形。一种戊糖片球菌，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）具有优良的牛乳发酵能力：在37℃-43℃下，利用牛乳中的乳糖进行发酵产生乳酸，造成ph降低使乳凝固，凝乳无异味。一种戊糖片球菌，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）具有优良的牛乳发酵能力：在12%灭菌全脂乳培养基中连续传代10次后，发酵能力稳定，仍能在37℃于12%灭菌全脂乳发酵12h产酸使乳凝固，凝乳无异味。一种戊糖片球菌，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）具有优良的牛乳发酵能力：利用高浓度（48%）的乳粉复原乳进行乳酸发酵：使乳凝固，凝乳无异味。一种戊糖片球菌，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）具有优良的牛乳发酵能力：在干酪生产中能加速成熟速度，促进蛋白分解以及风味形成。一种戊糖片球菌，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）制成的发酵乳产品风味优良，呈味物质含量高于普通酸奶，呈味物质包括2,3-戊二酮和3-羟基-2-丁酮。一种戊糖片球菌的应用，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）：发酵牛乳制成的高密度微生物纯培养物，可用于发酵乳、干酪等生产用的商业发酵剂。一种戊糖片球菌的应用，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）：供人摄取可肠道定植、调节肠道菌群、增强免疫力活性的微生物菌剂。一种戊糖片球菌的应用，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）：其他菌株做共生复配，按比例制成发酵剂应用于发酵乳、干酪、发酵肉、发酵果蔬汁、酸菜、泡菜发酵食品。一种戊糖片球菌的应用，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）：制备具有一定生理调节作用的保健食品或药品。一种戊糖片球菌，其生理生化特征为：实验序号底物成分结果0对照-1甘油-2赤藓醇-3d-阿拉伯糖-4l-阿拉伯糖+5核糖+6d-木糖-7l-木糖-8阿东醇-9β-甲基-d-木糖甙-10半乳糖+11葡萄糖+12果糖+13甘露糖+14山梨糖-15鼠李糖-16卫茅醇-17肌醇-18甘露醇-19山梨醇-20α-甲基-d-甘露糖甙-21α-甲基-d-葡萄糖甙-22n-乙酰葡糖胺+23苦杏仁甙+24熊果甙+25七叶灵+26柳醇+27纤维二塘+28麦芽糖+29乳糖+30蜜二糖+31蔗糖+32海藻糖+33菊糖-34松参糖-35棉子糖-36淀粉-37糖原-38木糖醇-39拢牛儿糖+40d-松二糖-41d-来苏糖-42d-塔格糖+43d-岩糖-44l-岩糖-45d-阿拉伯糖醇-46l-阿拉伯糖醇-47葡萄糖酸盐-482-酮基-葡萄糖酸盐-495-酮基-葡萄糖酸盐-一种戊糖片球菌，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）16srdna全序列为seqidno.1所示。一种戊糖片球菌，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）分离自温州泰顺山区传统发酵泡菜，所使用的分离培养基为mrs-g培养基，培养温度为37℃，样品稀释液24h培养后，挑取平板上单菌落进行分离纯化培养，其菌落形态学特征为：圆形菌落，乳白色，光滑，微凸起，边缘整齐，不透明。一种戊糖片球菌，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）在分离纯化时挑取部分菌体做革兰氏染色并光学显微镜观察进行进一步筛选，其菌体形态特性为：革兰氏阳性，无芽孢形成，球形。一种戊糖片球菌，戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）作为菌种发酵剂发酵牛乳，制成的发酵乳产品风味优良，2,3-戊二酮和3-羟基-2-丁酮等呈味物质含量高于普通酸奶，发酵乳风味物质spme-gc-ms检测结果如下：本发明所公开的戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）用途：1、发酵牛乳制成的高密度微生物纯培养物，添加或不添加保护剂，经过或不经过深冻，可用于发酵乳、干酪等生产用的商业发酵剂；2、供人摄取可肠道定植、调节肠道菌群、增强免疫力等活性的微生物菌剂；3、与其他菌株做共生复配，按一定比例制成发酵剂应用于发酵乳、干酪、发酵肉、发酵果蔬汁、酸菜、泡菜等发酵食品；4、制备具有一定生理调节作用的保健食品或药品。实施例2，样品准备过程如下：1）取温州泰顺山区农家的传统手工泡菜样品若干，置于无菌样品瓶中，密封带回实验室；2）第二天取带汁泡菜样品，无菌匀浆；3）取浆液1ml，加到9ml灭菌生理盐水中，振荡均匀，进行梯度稀释、取适当比例做mrs平板涂布37℃培养48h。划线分离纯化过程如下：1)记号笔于平板底物相应位置圈选标注平板上菌落特征为圆形、乳白色、表面光滑、微凸起、边缘整齐、不透明的单菌落；2）使用接种环挑取小部分该单菌落菌体做革兰氏染色并镜检，要求目标菌体特征为革兰氏阳性，无芽孢形成，球形，直径约0.8~1.0μm；3）挑取该单菌落进行mrs平板划线分离，反复2-3次纯化培养，以得到纯化的单一菌落，保藏于-45度冰箱，菌种编号并用于后续操作。取已分离纯化的菌株，经过如下基因测序鉴定过程：1）使用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒并按照操作说明书提取目标菌的dna基因；2)使用appliedbiosystems品牌的2720thermalcycler型号的pcr仪对基因片段进行扩增。用细菌通用引物对上游引物27f(序列：5’-agtttgatcmtggctcag-3’)和下游引物1492r(序列：5’-ggttaccttgttacgactt-3’)扩增16srdna序列，反应条件为：94度预变性4min后进入以下循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环，72℃修复延伸10min；3）经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定条带单一、清晰，范围合适，结果良好。4）扩增产物使用appliedbiosystems品牌的3730xl型号的基因测序仪测序，结果如seqidno.1所示，在ncbi网站上进行blast序列比对，初步确定为戊糖片球菌。取已分离纯化的菌株，经过如下api生理生化鉴定过程：1）接种于mrs平版上，于37℃培养48h，用无菌棉签挑取几个菌落形态一致的菌落，在api50chl培养基中制得浑浊度相当于2个麦氏浊度的菌悬液，混匀。2）将以上菌悬液接种到api50ch试验条中，无菌矿物油覆盖密封，于37℃培养48h。3）结果判定：试剂条变为黄色（25号管变为黑色）为阳性反应，变为绿色（25号管除外）为弱阳性反应，不变色为阴性反应，根据生理生化鉴定结果推定为戊糖片球菌。目标菌种经过16s基因测序鉴定和生理生化鉴定一致，最终确定为戊糖片球菌。实施例3牛乳发酵产香优良戊糖片球菌的筛选经过分离纯化并鉴定的菌株需要经过乳基质发酵性能筛选确定其工业可应用性。牛乳发酵所使用的原料为全脂鲜牛乳，其主要组成：蛋白含量2.9g/ml，脂肪含量3.3g/ml，碳水化合物含量4.6g/ml。种子制备过程如下：1）全脂鲜牛乳115℃20min灭菌后，冷却到40-50℃，备用；2）每100ml接种1ml的目标菌株纯培养物，37℃发酵约12h，种子滴定酸度达到200-220吉尔尼尔度以上为发酵终点。种子在2d内使用，4℃保藏。发酵乳制备过程如下：1）全脂鲜牛乳经过105℃15min杀菌后，冷却到40-50℃；2）每100ml接种2ml的种子，42℃发酵约4-6h，发酵乳滴定酸度达到70-80吉尔尼尔度为发酵终点。发酵乳感官评定为：呈乳白色或微黄色，色泽均匀一致；组织状态细腻、均匀；有发酵乳特有的滋味和气味，无异味。实施例4高浓度复原牛乳发酵实验高浓度复原牛乳发酵实验所使用的培养基为全脂复原牛乳，其主要成分比例为蛋白：脂肪：碳水化合物=2.9：3.3：4.6。全脂复原牛乳的浓度（w/v）分别为12%。24%，36%，48%。种子培养液制备过程如下：1）12%（w/v）全脂复原牛乳培养基115℃20min灭菌后，冷却到40-50℃，备用；2）每100ml接种1ml的目标菌株纯培养物，37℃发酵约12h，种子培养液滴定酸度达到200-220吉尔尼尔度以上为发酵终点。种子培养液在2d内使用，4℃保藏。发酵乳制备过程如下：1）不同浓度的全脂复原牛乳经过105℃15min杀菌后，冷却到40-50℃；2）每100ml接种2ml的种子培养液，42℃分别发酵4h或6h。干物质含量分别为12%。24%，36%，48%的发酵乳滴定酸度结果见图1，分别为97、91、85、76吉尔尼尔度。干物质含量48%发酵乳产品酸度符合国标对发酵乳的要求，呈乳白色或微黄色，色泽均匀一致；组织状态细腻、均匀；有发酵乳特有的滋味和气味，无异味。实施例5应用于发酵干酪种子制备过程如下：1）全脂鲜牛乳115℃20min灭菌后，冷却到40-50℃，备用；2）每100ml接种1ml的目标菌株纯培养物，37℃发酵约12h，种子滴定酸度达到200-220吉尔尼尔度以上为发酵终点。种子在2d内使用，4℃保藏。cheddar干酪的生产工艺流程如下：原料乳→标准化（蛋白：脂肪=0.7）→杀菌（72℃、15s）→冷却（32℃）→接种发酵（接种量1.0-2.0%，至ph=6.2-6.3）→添加凝乳酶（小牛皱胃酶，添加量由酶活力决定）→凝块切割（1cm3）→搅拌升温（38-45℃）→保温搅拌（38-45℃，40-60min）→排乳清→堆酿（室温，至ph=5.5-5.6）→磨碎加盐（2-7%）→压榨（过夜）→真空包装→成熟（6-8℃，通过蛋白分解率指标，ph4.6可溶性氮是否达到10%，或三氯乙酸可溶性氮是否达到6%，来判定是否成熟）。不同菌种发酵剂的干酪成熟时间比对结果见图2，表明戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）干酪ph4.6可溶性氮、三氯乙酸可溶性氮指标在14d时分别达到9.9%和6.1%，在干酪生产中能加速成熟速度，促进蛋白分解以及风味形成：优于乳酸乳球菌乳酸亚种发酵剂的28d。实施例6应用于商业的活菌制剂种子发酵液制备过程如下：1）12%（w/v）全脂复原牛乳培养基115℃60min灭菌后，冷却到40-50℃，备用；2）每100l接种1l的目标菌株纯培养物，37℃发酵约12h，种子培养液滴定酸度达到200-220吉尔尼尔度以上为发酵终点。种子发酵液在4d内使用，4-8℃储存。冻干菌粉的生产过程如下：如上种子发酵液，经过或不经过离心浓缩，加入或不加入一定比例的冻干保护剂（如甘油、海藻糖等），加入或不加入一定比例的稳定剂（如白蛋白、磷酸盐、甘露醇等），经过搅拌混匀、冷冻干燥、破碎混匀而制成的产品。可直接食用菌粉生产过程如下：如上冻干菌粉，加入或不加入一定比例的益生元（低聚乳糖、低聚果糖等）、加入或不加入一定比例的粉状香味剂（如苹果冻干粉、草莓冻干粉等）、加入或不加入一定比例的助溶剂（如麦芽糊精），经过混料、定量包装而制成的产品。调整冻干菌粉的比例，使每克最终产品的菌数达到106cfu/ml。虽然本发明已通过参考优选的实施例进行了描述，但是，本领域普通技术人员应当了解，可以不限于上述实施例的描述，在权利要求书的范围内，可作出形式和细节上的各种变化。序列表<110>浙江一鸣食品股份有限公司<120>一种戊糖片球菌及其应用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1411<212>dna<213>戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）<400>1cacgtggaacgagcttccgttaattgattatgacgtacttgtactgattgagattttaac60acgaagtgagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccagaagtaggggata120acacctggaaacagatgctaataccgtataacagagaaaaccgcatggttttcttttaaa180agatggctctgctatcacttctggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaa240aggctcaccaaggcagtgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggact300gagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaa360gtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgtt420aaagaagaacgtgggtaagagtaactgtttacccagtgacggtatttaaccagaaagcca480cggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggattta540ttgggcgtaaagcgagcgcaggcggtcttttaagtctaatgtgaaagccttcggctcaac600cgaagaagtgcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatg660tgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggt720ctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtag780tccatgccgtaaacgatgattactaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagc840taacgcattaagtaatccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaagaattg900acgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaacctt960accaggtcttgacatcttctgacagtctaagagattagaggttcccttcggggacagaat1020gacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaa1080cgagcgcaacccttattactagttgccagcattaagttgggcactctagtgagactgccg1140gtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggc1200tacacacgtgctacaatggatggtacaacgagtcgcgagaccgcgaggttaagctaatct1260cttaaaaccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcg1320ctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcc1380cgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaa1411序列表<110>浙江一鸣食品股份有限公司<120>一种戊糖片球菌及其应用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1411<212>dna<213>戊糖片球菌t036（pediococcus.pentosaceust036）<400>1cacgtggaacgagcttccgttaattgattatgacgtacttgtactgattgagattttaac60acgaagtgagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccagaagtaggggata120acacctggaaacagatgctaataccgtataacagagaaaaccgcatggttttcttttaaa180agatggctctgctatcacttctggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaa240aggctcaccaaggcagtgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggact300gagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaa360gtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgtt420aaagaagaacgtgggtaagagtaactgtttacccagtgacggtatttaaccagaaagcca480cggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagg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