基于FRET技术检测大肠杆菌O157:H7的方法与流程

本发明属于生物传感器领域，涉及食源性致病菌大肠杆菌o157:h7(escherichiacolio157:h7)的特异性检测，是一种基于fret(fluorescenceresonanceenergytransfer，荧光共振能量转移)技术和细胞内钙离子信号通路的b淋巴细胞生物传感器的构建。

背景技术：

在基于细胞的生物传感器cbbs中，全细胞通常被用作一个初级传感器，而二级传感器的构建通常依赖于细胞信号检测的类型。由于淋巴细胞卓越的特性及其巨大的应用潜力，在cbbs中已经应用了越来越多的淋巴细胞进行检测。其中，b细胞由于其自身能特异性识别抗原和需要通过bcr(bcellreceptor，b细胞受体)向t细胞进行抗原提呈的特性，在cbbs中显示出了优越的检测速度和检测特异性。b细胞是已知天然的最快速的致病菌识别元件，其固有反应时间小于1秒。当b细胞识别致病菌后，bcr会介导钙离子回流，该反应是b细胞应对抗原刺激的一个关键反应。当发生二价抗原或多价抗原与bcr的交联后，便会导致跨膜信号转导和抗原内化后的提呈。因为钙离子在调控不同的细胞活动时有着重要作用，因此使用荧光指示剂的钙离子成像在原代细胞和组织中的生理学研究具有越发重要的作用。遗传编码的钙离子指示剂(geneticallyencodedca²⁺indicators，gecis)是绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)技术的最大受益者之一，它是将荧光蛋白与生物钙离子传感器串联得到的。gecis已经成为了继水母蛋白和化学钙离子指示剂之后，检测胞内钙离子浓度时的一种非常有价值的工具。基于gfp构建的钙离子指示剂可以很好地克服水母蛋白和化学合成指示剂的不足。其中一个高效的自组装的geci是tn-xxl。tn-xxl钙离子生物传感器是由来源于骨骼和心肌的钙离子结合蛋白肌钙蛋白(troponinc，tnc)衍生而来的，它已经被成功地应用于大量研究中，诸如从果蝇和小鼠的神经细胞直到小鼠的t细胞。据我们所知，还没有tn-xxl被用于b细胞检测食源性微生物中。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种基于fret技术检测大肠杆菌o157:h7的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于fret技术检测大肠杆菌o157:h7的方法，依次包括以下步骤：

1)、培养b细胞：将b细胞培养至指数生长期；

2)、将遗传编码钙离子荧光指示剂质粒tn-xxl电转化入指数生长期的b细胞，得表达tn-xxl的b细胞；

该表达tn-xxl的b细胞作为基于fret检测大肠杆菌o157:h7的细胞生物传感器；

3)、将表达tn-xxl的b细胞与待测物接触时，通过光漂白法测定fret效率；

当大肠杆菌o157:h7细菌浓度高时，所检测到的fret效率相对较高。

作为本发明的基于fret技术检测大肠杆菌o157:h7的方法的改进：

步骤1)中使用的b细胞培养基为dmem培养基与hifbs(热灭活胎牛血清)按照9:1的体积比混合而得。

所述dmem培养基为含有4mml-谷氨酰胺和1.5g/l的碳酸氢钠，4.5g/l的葡萄糖，1vol％的非必须氨基酸(memnaa)的dmem培养基。

作为本发明的基于fret技术检测大肠杆菌o157:h7的方法的进一步改进：步骤2)中，取指数生长期生长的b细胞，使用电转化技术将质粒tn-xxl转染到b细胞中(bio-radgene-pulser,bio-rad,hercules,ca,usa)，电转化时使用0.35ml浓度为1.43×10⁶cells/ml的b细胞和3μg的tn-xxl质粒dna，电转化的工艺参数为：0.4cm电转化杯，500v(bio-radgenepulserxcelltmelectroporationsystems)。

本发明构建一种新型的细胞生物传感器，它利用遗传编码钙离子指示剂tn-xxl对胞内钙离子的灵敏性和b细胞对致病菌反应的快速性，结合fret技术，提供一种检测食源性致病菌e.colio157:h7的新的检测方法。该方法是一种全新的细胞生物传感器的构建方法(图1)。

本发明根据b细胞对e.colio157:h7的特异性和tn-xxl对胞内钙离子的敏感性特性，构建了含有钙离子荧光指示剂的b细胞生物传感器。本发明将表达tn-xxl的b细胞与不同浓度e.colio157:h7菌体细胞混合后，b细胞就会捕获细菌细胞，从而引发b细胞表面的bcr介导的胞内钙离子激流，tn-xxl的构象发生变化从而引发了fret效率发生改变，通过共聚焦显微镜对fret效率的测定，从而确定待测样品中是否含有靶标致病菌。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1基于fret的细胞生物传感器快速检测食源性致病菌e.colio157:h7的原理示意图。

图2不同浓度e.colio157:h7的fret效率对比图。

图3该细胞生物传感器的roc曲线图。

图4饮用水中靶标细菌e.colio157:h7的测定对比图。

具体实施方式

实施例1、一种基于fret技术检测食源性致病菌escherichiacolio157:h7的方法，依次进行以下步骤：

1)b细胞培养：

b细胞培养基为在900ml的dmem培养基中加入100mlhifbs(热灭活胎牛血清)而得。该dmem培养基为含有4mml-谷氨酰胺和1.5g/l的碳酸氢钠，4.5g/l的葡萄糖，1vol％的非必须氨基酸(memnaa)的dmem培养基。细胞在37℃，二氧化碳浓度为7％的二氧化碳培养箱中进行培养。

每次以1:10的比例(体积比)将b细胞接种至b细胞培养基中，于t25或t75细胞培养瓶中进行培养(falcon，oxnard，usa)，培养72h后；使用tc10自动细胞计数仪(bio-rad，hercules，ca，usa)进行细胞计数和细胞存活率的测定。取指数生长期的细胞进行后续试验。按照上述培养条件将b细胞传代至b细胞培养基；选用代数为5-10代的b细胞保存在液氮中。

2)电转化

取上述指数生长期生长的b细胞，使用电转化技术将质粒tn-xxl转染到b细胞中(bio-radgene-pulser,bio-rad,hercules,ca,usa)。电转化时使用0.35ml浓度为1.43×10⁶cells/ml的b细胞和3μg的tn-xxl质粒dna，电转化的工艺参数为：0.4cm电转化杯，500v(bio-radgenepulserxcelltmelectroporationsystems)；终体积约为0.4ml。在电转化后，立刻将转化后细胞置于t25细胞培养瓶中，加入10mlb细胞培养基进行过夜培养(在37℃，二氧化碳浓度为7％的二氧化碳培养箱中进行培养)。

3)光漂白检测fret效率

使用共聚焦显微镜zeisslsm780(carlzeissinc.，thornwood，ny)，用yfp通道中的514nm激光通道使用100％的激光能量对roi进行光漂白。在收集数据时，获得同一检测器补偿条件下漂白前和漂白后的图像进行分析。在光漂白之前，扫描三个漂白前的成像作为基线，然后进行光漂白直至50％的yfp荧光强度被漂白。

fret效率值用如下公式进行计算：

fretefficiency(％)＝[(cfppost-cfppre)/cfppost]×100；

其中，cfppre是光漂白之前的cfp信号，cfppost是光漂白之后的cfp信号。使用zeiss软件获得cfp和yfp在roi的信号值后，通过以上方程对roi的fret效率进行计算。在光漂白之前的roi的yfp信号降低和fret效率的增加都为0；当光漂白之后，yfp信号降低为50％，此时供体cfp的信号增强，这象征了fret效率的增强。

4)样品检测

当电转化48h后，表达tn-xxl的b细胞的浓度达到5.4×10⁵cells/ml时进行检测。将e.colio157:h7作为靶标致病菌，使用hbss对其梯度稀释为6.1×10¹～6.1×10⁸cfu/ml。

检测试验操作步骤简述如下：使用hbss代替致病菌作为空白对照组；使用e.colio157:h7作为靶标致病菌组；用hbss将b细胞洗涤三次后，在空白对照组中，将1ml洗涤后的b细胞与1ml的hbss温和混匀；在靶标致病菌组中，将1ml洗涤后的b细胞与1ml的致病菌混匀。取出20μl的混合物滴加至载玻片上用指甲油密封，置于室温黑暗中等待检测(按照上述步骤3)所述)。所有样本制备都是在检测之前新鲜制备，即制即测。

5)数据分析

试验数据为20个样本的重复试验，当不同浓度e.colio157:h7存在时，测得的fret有很大差别。根据图2，我们得知：当细菌浓度越高时，所检测到的fret效率相对较高。

空白对照组对应的fret效率(％)约为7.33092。

为了评估该生物传感器的准确性，我们绘制了roc曲线。可以利用roc曲线特征，初步进行评估细菌的浓度范围：当aur≤0.7时，细菌浓度小于10³cells/ml；当0.7＜aur＜0.9时，细菌浓度介于10⁴-10⁵cells/ml；当aur≥0.9时，细菌浓度大于10⁶cells/ml(图3)。

实验1、利用细胞生物传感器所得的细胞生物传感器，进行检测大肠杆菌o157:h7的方法，依次进行以下步骤：

1)样品制备：

在饮用水中加入大肠杆菌o157:h7，使其终浓度分别为5.6×10²，5.6×10⁵和5.6×10⁸cfu/ml，即分别为样品a、b和c。

2)样品检测：

将已经表达了tn-xxl质粒的浓度为4.9×10⁵cells/ml的b细胞分别与待测样品按照体积比1：1混合均匀，立刻置于共聚焦显微镜zeisslsm780下分别进行fret效率检测。所得结果如图4所示，当靶标细菌浓度为5.6×10²，5.6×10⁵和5.6×10⁸cfu/ml时，样品a、b和c所测得fret效率(％)分别为9.851±0.8582,13.96±0.8712和18.31±0.7875。与空白对照(bc)相比均有显著性差异(p﹤0.0001)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。