本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵法生产硫酸软骨素的方法。
背景技术：
硫酸软骨素是糖胺聚糖的一种，由d-葡糖醛酸和n-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷键连接而成的重复二糖单位组成的多糖，并在n-乙酰氨基半乳糖的c-4位或c-6位羟基上发生硫酸酯化。根据硫酸基在半乳糖上位置不同、以及化学组成和结构差异，可分为a、b、c、d、e、f、h等多种，通常从哺乳动物组织中提取得到的硫酸软骨素以硫酸软骨素a(cs-a)、和硫酸软骨素c(cs-c)为主。
硫酸软骨素是一类重要的生物高分子，具有广泛的生物活性，其作为安全有效的保健食品和药品在世界各国得到了广泛应用。硫酸软骨素的生物活性主要包括：镇痛抗炎作用，促进成骨细胞增生、诱导新骨形成作用，抗肿瘤作用，抗粘连作用，免疫调节作用，调血脂、抗动脉粥样硬化作用，抗氧化、清除自由基和廷缓衰老的作用；除此之外，cs还具有抗炎、抗病毒、抗过敏和加速伤口愈合的作用，如抗hiv活性等。在欧、美、日等发达国家，硫酸软骨素作为保健品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病，并且无明显的毒副作用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。
目前，传统的生产硫酸软骨素的方法主要是以碱法和酶法提取法从猪、牛、鸡、鲨鱼等动物软骨中提取获得，传统生产硫酸软骨素的方法存在原材料匮乏、不容易形成规模、收集原料的成本高、质量不稳定、纯度不好控制、提取复杂、生产造成污染等诸多问题。近几年，国外不断有文献报道发现一些菌株可发酵生产软骨素的类似物，微生物发酵生产软骨素或软骨素类似物的研究越来越受到人们的关注。发酵法生产cs不受原材料限制，具有发酵成本低、环境污染小的优势，成为最具经济效益和开发潜力的硫酸软骨素生产方法。但是，发酵法生产硫酸软骨素的研究尚处于初级阶段，硫酸软骨素的产量依然较低。
技术实现要素：
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种发酵法生产硫酸软骨素的方法，以解决现有技术中硫酸软骨素产量较低的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的发酵法生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤：
(1)取巨大芽孢杆菌株接种至种子液培养基中进行种子活化培养，得到巨大芽孢杆菌种子液；
(2)配制发酵培养基，包括：葡糖糖40-60g/l、k2hpo49-10g/l、kh2po41.5-2.5g/l、酵母提取物12-18g/l、柠檬酸三钠0.3-0.8g/l、(nh4)2so40.8-1.2g/l、mgcl20.05-0.2g/l，初始ph7.4-7.6，灭菌，备用；
(3)将步骤(1)所得巨大芽孢杆菌种子液接种至步骤(2)所得发酵培养基中，于35-40℃进行发酵，得到含硫酸软骨素发酵液。
所述步骤(3)中，所述发酵步骤中，控制通气量为30-35m3/h，维持压力0.08mpa，并在溶氧低于70时，调整压力为0.1mpa。
所述步骤(1)中，所述种子液培养基包括：葡糖糖8-12g/l、k2hpo49.5-10g/l、kh2po41.5-2.5g/l、酵母提取物1.5-2.5g/l、柠檬酸三钠0.3-0.8g/l、(nh4)2so40.8-1.2g/l、mgcl20.05-0.2g/l，初始ph7.4-7.6，灭菌，备用。
所述步骤(3)中，还包括将葡萄糖酸杆菌种子液接种至所述发酵培养基的步骤。
所述步骤(3)中，所述葡萄糖酸杆菌种子液的接种是在所述巨大芽孢杆菌种子液接种后2-4h加入。
所述葡萄糖酸杆菌种子液是将所述葡萄糖酸杆菌接种至与步骤(1)中相同的种子培养基中活化培养得到。
所述步骤(3)中，所述巨大芽孢杆菌种子液的接种量为4-6v/v％，所述葡萄糖酸杆菌种子液的接种量为2-3v/v％。
所述步骤(3)之后，还包括对所得含硫酸软骨素发酵液进行纯化提取的步骤，具体包括：
(4)酶解：取所得发酵液固液分离并收集滤液，调节滤液ph9.5-10，并加入碱性蛋白酶进行酶解处理；随后将酶解后的料液过滤，并用50k卷膜进行超滤处理，至滤液电导率降至2-3.5ms/cm，备用；
(5)酸解：将超滤处理后的料液转移至酸解罐内，升温至85-90℃，调节ph2.3-2.5，至料液出现大量沉淀物，随后过滤收集料液，调节料液ph至中性，并用30k板式超滤膜进行超滤处理，至滤液电导率降至0.9ms/cm，备用；
(6)碱解：将所得料液升温至50-55℃，调节ph11-12，并加入双氧水保温处理4-5h，以氧化去除所含内毒素；
(7)精制：将所得料液加酒精进行沉淀，脱水后进行抽滤处理，收集软骨素固体，真空干燥，收集软骨素粉末，保存。
所述步骤(4)中，还包括在固液分离后将所得滤液冷却至0℃并保温30-60min的步骤，随后自然解冻至室温。
所述步骤(4)中，还包括在碱性蛋白酶酶解后，加入蛋白酶k继续酶解10-20min的步骤。
本发明所述发酵法生产硫酸软骨素的方法，以巨大芽孢杆菌为发酵菌株，通过精心筛选的发酵培养基进行发酵培养，所得发酵液中硫酸软骨素的含量较高。
进一步的，本发明所述生产硫酸软骨素的方法，利用葡萄糖酸杆菌与所述巨大芽孢杆菌进行联合发酵，并优选在所述巨大芽孢杆菌接种后接入所述葡萄糖酸杆菌，进一步大幅提高了所述硫酸软骨素的产量，而实验结果也表明，单独使用葡萄糖酸杆菌进行发酵培养的方式，几乎不产生硫酸软骨素，可见，本发明方法利用葡萄糖酸杆菌的辅助发酵方式，取得了预料不到的技术效果。
本发明所述生产硫酸软骨素的方法，利用现有酶解-酸解-碱解的方法进行硫酸软骨素目标产物的纯化提取，所得纯化产品的收率较高。
进一步的，本发明所述方法，在所述提取方法中利用蛋白酶k共同进行酶解纯化提取，进一步提高了目标产物的收率。
具体实施方式
实施例1
本实施例所述的发酵法生产硫酸软骨素的方法，具体包括如下步骤：
(1)配制种子液培养基包括：葡糖糖8g/l、k2hpo410g/l、kh2po41.5g/l、酵母提取物2.5g/l、柠檬酸三钠0.3g/l、(nh4)2so41.2g/l、mgcl20.05g/l，调初始ph7.6；
按照上述原料所示，配制摇瓶培养基3l，其中葡萄糖溶液单独配制，随后将培养基溶液转移至5l三角瓶内，葡萄糖溶液转移至500ml三角瓶内，瓶口用8层纱布和一层牛皮纸密封，将培养基置于灭菌锅内，设置灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min；
灭菌结束后，将培养基与葡萄糖溶液置于无菌操作台中冷却至室温，在无菌操作台中，将葡萄糖溶液转移至培养基溶液中，并取巨大芽孢杆菌株接种至所得种子液培养基中，接种结束后，用8层纱布密封摇瓶，将摇瓶置于摇床内，设置温度35℃，培养时间9h，得到巨大芽孢杆菌种子液；
(2)配制发酵培养基，包括：葡糖糖40g/l、k2hpo410g/l、kh2po41.5g/l、酵母提取物18g/l、柠檬酸三钠0.3g/l、(nh4)2so41.2g/l、mgcl20.05g/l，控制初始ph7.6；
根据上述原料，将葡萄糖置于灭菌罐内配置成80l溶液，并灭菌，灭菌温度为118℃，灭菌时间为30min，将剩余培养基原料置于500l发酵罐内，配置成200l溶液，并灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min，灭菌结束后，将葡萄糖溶液转移至发酵罐内，在罐内维持正压力，冷却至35℃，备用；
(3)将步骤(1)中所得巨大芽孢杆菌种子液，按照4v/v％的接种量接种至步骤(2)所得发酵培养基中，调整发酵罐内溶液初始ph7.6，以氨水维持发酵液ph值7.6，控制发酵罐保温37℃进行发酵，过程中调整通气量为30m3/h，维持压力0.08mpa，在溶氧低于70时，调整压力为0.1mpa；于接种后开始计时，每小时测发酵液od600，并在发酵液ph和溶氧开始上升时，再次计时，并维持该状态4.5h，该过程为产物积累时间，得到含硫酸软骨素发酵液。
实施例2
本发明所述的发酵法生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤：
(1)配制种子液培养基包括：葡糖糖12g/l、k2hpo49.5g/l、kh2po42.5g/l、酵母提取物1.5g/l、柠檬酸三钠0.8g/l、(nh4)2so40.8g/l、mgcl20.2g/l，调初始ph7.4，配制及灭菌方法同实施例1；
取巨大芽孢杆菌株接种至上述种子液培养基中进行种子活化培养，设置温度37℃，培养时间9h，得到巨大芽孢杆菌种子液；
(2)配制发酵培养基，包括：葡糖糖40g/l、k2hpo49g/l、kh2po42.5g/l、酵母提取物12g/l、柠檬酸三钠0.8g/l、(nh4)2so40.8g/l、mgcl20.2g/l，初始ph7.4，灭菌，备用，配制及灭菌方法同实施例1；
(3)将步骤(1)中所得巨大芽孢杆菌种子液，按照6v/v％的接种量接种至步骤(2)所得发酵培养基中，调整发酵罐内溶液初始ph7.4，以氨水维持发酵液ph值7.4，控制发酵罐保温40℃进行发酵，过程中调整通气量为35m3/h，维持压力0.08mpa，在溶氧低于70时，调整压力为0.1mpa；于接种后开始计时，每小时测发酵液od600，并在发酵液ph和溶氧开始上升时，再次计时，并维持该状态4.5h，该过程为产物积累时间，得到含硫酸软骨素发酵液。
实施例3
本发明所述的发酵法生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤：
(1)配制种子液培养基包括：葡糖糖10g/l、k2hpo49.7g/l、kh2po42.0g/l、酵母提取物2.0g/l、柠檬酸三钠0.5g/l、(nh4)2so41.0g/l、mgcl20.1g/l，调初始ph7.5，配制及灭菌方法同实施例1；
取巨大芽孢杆菌株接种至种子液培养基中进行种子活化培养，设置温度37℃，培养时间9h，得到巨大芽孢杆菌种子液；
(2)配制发酵培养基，包括：葡糖糖40g/l、k2hpo49.7g/l、kh2po42g/l、酵母提取物15g/l、柠檬酸三钠0.5g/l、(nh4)2so41.0g/l、mgcl20.1g/l，初始ph7.5，灭菌，备用，配制及灭菌方法同实施例1；
(3)将步骤(1)中所得巨大芽孢杆菌种子液，按照5v/v％的接种量接种至步骤(2)所得发酵培养基中，调整发酵罐内溶液初始ph7.5，以氨水维持发酵液ph值7.5，控制发酵罐保温37℃进行发酵，过程中调整通气量为32.7m3/h，维持压力0.08mpa，在溶氧低于70时，调整压力为0.1mpa；于接种后开始计时，每小时测发酵液od600，并在发酵液ph和溶氧开始上升时，再次计时，并维持该状态4.5h，该过程为产物积累时间，得到含硫酸软骨素发酵液。
实施例4
本实施例所述生产硫酸软骨素的方法同实施例3，其区别仅在于，所述步骤(3)中，还包括取葡萄糖酸杆菌接种至发酵培养基中进行联合发酵的步骤，具体的，取葡萄糖酸杆菌接种至与步骤(1)中相同的种子培养基中活化培养，得到葡萄糖酸杆菌种子液，并在接种所述巨大芽孢杆菌种子液的同时，按照2v/v％的接种量将所述葡萄糖酸杆菌种子液接种至发酵培养基中。
实施例5
本实施例所述生产硫酸软骨素的方法同实施例3，其区别仅在于，所述步骤(3)中，还包括取葡萄糖酸杆菌接种至发酵培养基中进行联合发酵的步骤，具体的，取葡萄糖酸杆菌接种至与步骤(1)中相同的种子培养基中活化培养，得到葡萄糖酸杆菌种子液，并在接种所述巨大芽孢杆菌种子液之后2h，按照3v/v％的接种量将所述葡萄糖酸杆菌种子液接种至发酵培养基中。
实施例6
本实施例所述生产硫酸软骨素的方法同实施例3，其区别仅在于，所述步骤(3)中，还包括取葡萄糖酸杆菌接种至发酵培养基中进行联合发酵的步骤，具体的，取葡萄糖酸杆菌接种至与步骤(1)中相同的种子培养基中活化培养，得到葡萄糖酸杆菌种子液，并在接种所述巨大芽孢杆菌种子液之后4h，按照3v/v％的接种量将所述葡萄糖酸杆菌种子液接种至发酵培养基中。
对比例1
本对比例所述生产硫酸软骨素的方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵过程采用葡萄糖酸杆菌进行发酵。
实施例发酵液中硫酸软骨素含量测定
1、硫酸软骨素产量的测定方法
本发明对所得发酵液中硫酸软骨素含量的测定采用现有技术种方法进行，具体参照中国专利cn102220270a中方法进行，具体操作为：取待检测发酵液于3000rpm离心30min，收集上清液，并以鲨鱼硫酸软骨素作为标准品，配制100、200、300、400、500mg/l的标准溶液；将上清液与标准溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定硫酸软骨素的含量。
色谱条件：
色谱柱：150mmzorbaxsb-aq；
流动相：乙腈-2.28mmol/l四甲基氯化铵水溶液(体积比为10：90)，用0.45μm滤膜过滤；
柱温：25℃；
检测波长：195nm；
进样量：10μl；
流速：0.5ml/min。
拟合回归方程y＝0.1469x-1.5009，r2＝0.9990，标准曲线在100-500mg/l之间呈现良好的线性关系，以此检测发酵液中硫酸软骨素的含量。
2、发酵液硫酸软骨素含量检测结果
按照上述检测方法对实施例1-6中发酵所得发酵液中的硫酸软骨素含量进行检测，记录结果于下表1。
表1发酵液中的硫酸软骨素含量
从上述数据可知，本发明所述生产硫酸软骨素的方法，利用巨大芽孢杆菌和葡萄糖酸杆菌联合发酵，有效提高了发酵液中硫酸软骨素的含量。
实施例7
本实施例所述纯化提取发酵液中硫酸软骨素的方法，具体包括如下步骤：
(4)酶解：取实施例5所得发酵液，以离心机固液分离并收集料液，离心结束后，将料液用0.22μm过滤板过滤，收集滤液，并调节滤液ph9.5-10，并加入占所述滤液体积0.5v/v％的碱性蛋白酶进行酶解处理3h；随后将酶解后的料液用0.22μm过滤板过滤，并用50k卷膜进行超滤处理，当料液浓缩至50l时，进行等体积超滤，直至滤液电导率降至2-3.5ms/cm，将料液浓缩至40-50l，备用；
(5)酸解：将超滤处理后的料液转移至酸解罐内，升温至85-90℃，调节ph2.3-2.5，维持该温度至料液出现大量沉淀物，随后冷却料液，用0.22μm过滤板过滤，收集料液并调节料液ph7.0，并用30k板式超滤膜进行超滤处理，当料液浓缩至5-6l时，进行等体积超滤，直至滤液电导率降至0.9ms/cm以下时，将料液浓缩至4-5l，备用；
(6)碱解：将所得料液升温至55℃，调节ph＝12，并加入占料液体积0.6v/v％的双氧水保温处理4-5h，以氧化去除所含内毒素；
(7)精制：将所得料液无菌操作台内，用原料酒精进行沉淀，上清酒精控制在65-70度，用原料酒精进行脱水，至上清酒精大于90度；脱水后，用沙芯漏斗进行抽滤，收集软骨素固体，并用真空干燥箱进行烘干，烘干温度为65℃，烘干后收集软骨素粉末，置于4℃冰箱中保存。
称取所得软骨素粉末量，计算单位体积发酵液所提取硫酸软骨素的提取量为755mg/l，计算硫酸软骨素的产物收率为81％。
实施例8
本实施例所述纯化提取发酵液中硫酸软骨素的方法同实施例7，其区别仅在于，所述步骤(4)中，还包括在固液分离后调节ph步骤前，将所得滤液冷却至0℃并保温30min的步骤，随后自然解冻至室温，再进行ph调节。
称取所得软骨素粉末量，计算单位体积发酵液所提取硫酸软骨素的提取量为792mg/l，计算硫酸软骨素的产物收率为85％。
实施例9
本实施例所述纯化提取发酵液中硫酸软骨素的方法同实施例7，其区别仅在于，所述步骤(4)中，还包括在固液分离后调节ph步骤前，将所得滤液冷却至0℃并保温60min的步骤，随后自然解冻至室温，再进行ph调节。
称取所得软骨素粉末量，计算单位体积发酵液所提取硫酸软骨素的提取量为802mg/l，计算硫酸软骨素的产物收率为86％。
实施例10
本实施例所述纯化提取发酵液中硫酸软骨素的方法同实施例9，其区别仅在于，所述步骤(4)中，还包括在碱性蛋白酶酶解后，加入占所述滤液体积0.5v/v％的蛋白酶k继续酶解10min的步骤。
称取所得软骨素粉末量，计算单位体积发酵液所提取硫酸软骨素的提取量为857mg/l，计算硫酸软骨素的产物收率为92％。
实施例11
本实施例所述纯化提取发酵液中硫酸软骨素的方法同实施例9，其区别仅在于，所述步骤(4)中，还包括在碱性蛋白酶酶解后，加入占所述滤液体积0.5v/v％的蛋白酶k继续酶解20min的步骤。
称取所得软骨素粉末量，计算单位体积发酵液所提取硫酸软骨素的提取量为876mg/l，计算硫酸软骨素的产物收率为94％。
从上述数据可知，本发明所述生产硫酸软骨素的方法，可有效提高发酵液中硫酸软骨素的产物收率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。